CRISPR) é unha técnica de edición xenómica de terceira xeración: CRISPR revolucionou o mundo

As repeticións palindrómicas curtas agrupadas e regularmente intercaladas (CRISPR, polas súas siglas en inglés) son unha técnica de edición xenómica de terceira xeración que revolucionou o mundo cos seus resultados de alto rendemento. Utilizouse para tratar diversas enfermidades e infeccións biolóxicas. Varias bacterias e outros procariotas (como as arqueas) tamén teñen sistemas CRISPR/Cas9 para defenderse dos fagos. Informouse de que as estratexias baseadas en CRISPR/Cas9 poden inhibir o crecemento e a progresión do cancro de mama triplo negativo (CMTN) ao dirixirse a xenes de resistencia potencialmente alterados, transcrición e regulación epixenética. Estas intervencións terapéuticas poden axudar a abordar problemas complexos como a resistencia a fármacos observada mesmo no CMTN. Actualmente, utilízanse varios métodos para administrar CRISPR/Cas9 ás células diana, como os físicos (microinxección, electroporación e modos hidrodinámicos), virais (virus adenoasociados e lentivirus) e non virais (liposomas e nanopartículas lipídicas). Aínda que se desenvolveron varios modelos para estudar as causas moleculares do TNBC, a falta de métodos sensibles e dirixidos para implementar ferramentas de edición xenómica in vivo limita a súa aplicación clínica. En resumo, esta revisión examina exhaustivamente o progreso, os desafíos, as limitacións e as perspectivas do tratamento CRISPR/Cas9 para o TNBC baseándose na evidencia existente. Tamén destacamos como a combinación de intelixencia artificial e aprendizaxe automática pode mellorar as estratexias CRISPR/Cas9 no tratamento do TNBC.
O cancro caracterízase por unha división celular incontrolada, a alteración dos puntos de control do ciclo celular e as mutacións nos xenes supresores de tumores (TSG) (Matthews et al., 2022). Entre os diferentes tipos de cancro, o cancro de mama é o tipo de cancro máis común nas mulleres e ten unha alta taxa de mortalidade en todo o mundo (Waks e Winer, 2019). O cancro de mama é unha enfermidade heteroxénea con diversas características, como as características histolóxicas e biolóxicas, a presentación e o comportamento clínicos e a resposta ao tratamento (Weigelt et al., 2010). A clasificación do cancro de mama proporciona información precisa para o diagnóstico do cancro de mama e o prognóstico tumoral. O uso de biomarcadores comúns e características clinicopatolóxicas foi o criterio principal para a clasificación do cancro de mama (Tsang e Tse, 2019). O prognóstico e a resposta ao tratamento do cancro de mama están influenciados por numerosos factores, incluíndo a presenza do receptor de estróxenos (ER), o receptor de proxesterona (PR), o receptor 2 do factor de crecemento epidérmico humano (HER2/neu) e o grao histolóxico, o tipo e o grao do tumor. tamaño e metástase nos ganglios linfáticos (Al-Tubaiti, 2020). Identificáronse cinco subtipos moleculares intrínsecos de cancro de mama, incluíndo luminal A, luminal B, enriquecido en HER2, de tipo basal e de claudina baixa (Prat et al., 2015). O cancro de mama triplo-negativo (TNBC) é un subtipo molecular de cancro que non expresa todos os ER, PR e HER2 (Yin et al., 2020). Estas características patolóxicas están asociadas co TNBC, o que confirma a súa rápida progresión e a súa natureza máis agresiva que calquera outro tipo de cancro de mama (Feng et al., 2018). Ademais, Peru et al. (2000) utilizaron a tecnoloxía de microarrays para reclasificar o cancro de mama e identificar cinco subtipos intrínsecos de cancro de mama (Cadenas, 2012). O cancro de mama de tipo basal é un subtipo de cancro de mama que ten un fenotipo triplo negativo e está asociado a unha progresión rápida. Cómpre sinalar que todos os cancros de mama de tipo basal adoitan diagnosticarse erroneamente como cancro de mama tripla (CMTN), pero só o 77 % son CMTN; pola contra, entre o 71 e o 91 % dos CMTN son de tipo basal, o que indica que estes dous tipos de cancro de mama se solapan e representan clasificacións diferentes (Wang D.-Y. et al., 2019). Isto crea a necesidade de caracterizar a heteroxeneidade do CMTN para dilucidar o prognóstico e identificar posibles respostas aos tratamentos actuais e futuros. Ademais, o CMTN representa entre o 15 e o 20 % de todos os casos de cancro de mama e é máis común en mulleres menores de 50 anos. Informáronse de mutacións BRCA1 ou BRCA2 en aproximadamente o 20 % dos casos de CMTN (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Os estudos tamén demostraron que o TNBC ten un microambiente inmunitario distintivo que inclúe altos niveis de factores de crecemento endotelial vascular, macrófagos asociados a tumores (TAM), linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) e outras moléculas implicadas no crecemento e migración tumoral. Polo tanto, comprender o microambiente do TNBC é fundamental para o seu prognóstico e tratamento (Fan e He, 2022).
Para avaliar o prognóstico do cáncer de mama trigemino (CMTN) e garantir un tratamento eficaz, é importante un diagnóstico preciso, baseado principalmente na inmunohistoquímica (IHQ) para detectar RE, PR e HER2, e a mamografía para detectar neoplasias mamarias. Non obstante, a mamografía non pode representar adecuadamente as características intratumorais como a necrose e a fibrose (Deepak Singh et al., 2021). Dado que un prognóstico e un diagnóstico desfavorables impiden que os médicos prescriban os medicamentos axeitados (Chaudhary, 2020), utilízanse varias estratexias para mellorar a atención ás pacientes con CMTN. Actualmente, utilízanse dous fármacos, a doxorrubicina e a ciclofosfamida, en pacientes con CMTN e mostraron bos resultados. Ademais, utilízanse outros fármacos de platino, como o carboplatino e o cisplatino (Sikov et al., 2015). Ademais, os inhibidores de PARP como o olaparib, o velaparib e o PF-01367338 utilizáronse como posibles fármacos de quimioterapia para o tratamento do CMTN (Ishino et al., 2018). Dado que se informou de que as vías de sinalización Wnt/b-catenina, NOTCH e Hedgehog están implicadas na aparición e progresión do TNBC, a dirección de fármacos a estas vías pode ser unha estratexia importante (Aysola et al., 2013). Aínda que a cirurxía, a radioterapia e a quimioterapia seguen sendo o piar do tratamento para o TNBC na actualidade, fixéronse progresos significativos no desenvolvemento de novos tratamentos, incluíndo a terapia dirixida, a inmunoterapia, varias ferramentas de edición xénica relacionadas con CRISPR como Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, a edición principal e a terapia xénica dirixida a CRISPR/Cas9. Aquí centrarémonos en varias ferramentas de edición xénica relacionadas con CRISPR utilizadas no tratamento do TNBC. Entre elas, CRISPR/Cas9 recibiu unha atención ampla.
Cas9n, tamén coñecida como Cas9 nickase, é unha variante modificada xeneticamente da proteína Cas9 derivada do sistema de edición do xenoma CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Na súa forma orixinal, a proteína Cas9 contén dous dominios nuclease: RuvC e HNH, cuxa función principal é a clivaxe de ambas as dúas cadeas de ADN. Non obstante, en Cas9n, un dos dominios nuclease, HNH, muta xeneticamente e vólvese inactivo. Polo tanto, o dominio HNH de Cas9n permanece non funcional. Só o dominio RuvC permanece activo, o que permite que Cas9n corte ou cree roturas en cadeas de ADN individuais (Trevino e Zhang, 2014). En comparación con Cas9, Cas9n pode reducir eficazmente os efectos fóra do obxectivo e mellorar con precisión os mecanismos de reparación celular. Cas9n pódese usar para resolver varios problemas, como a creación de roturas en lugares específicos no ADN bicatenario. Para este propósito, combináronse dúas moléculas de Cas9n e usáronse xuntas (Yee, 2016). A quinase de liñaxe mixta 3 (MLK3) é unha proteína quinase activada por mitóxenos que serve como regulador clave durante a metástase dos TNBC (Cronan et al., 2012).
A MLK3 pode activar múltiples vías de sinalización que levan á metástase dos tumores trigástricos (TNBC). Por exemplo, a vía da quinase N-terminal c-Jun (JNK) regula a motilidade celular e a degradación da matriz extracelular, e a MLK3 activa a vía JNK, mellorando así a motilidade celular e confiríndolle propiedades invasivas (Rattanasinchai e Gallo, 2016). A MLK3 tamén regula a EMT. Para iso, activa factores de transcrición augas abaixo como Snail, Slug e Twist. Estes factores inhiben a expresión de marcadores epiteliais e promoven a expresión de marcadores mesenquimais, o que leva á adquisición dun fenotipo metastásico (Casalino et al., 2023). Observouse que a MLK3 desempeña un papel na remodelación da matriz extracelular (ECM) e na activación de proteases como as metaloproteinases da matriz (MMP) que degradan a ECM. Isto facilita a invasión das células tumorais e a súa propagación a sitios distantes (Katari et al., 2019). Polo tanto, estudos previos demostraron que a MLK3 desempeña un papel fundamental no TNBC. Rattanasinchai e Gallo empregaron modelos de células triángulos superciliares (TNBC) para estudar o papel de MLK3 e descubriron que promove o desenvolvemento do cancro a través de vías de sinalización específicas. Empregaron CRISPR/Cas9n para editar MLK3 e observaron unha redución significativa na metástase de TNBC (Rattanasinchai e Gallo, 2016).
O dCas9, a miúdo chamado Cas9 inactivo, é unha forma derivada modificada da proteína Cas9. A diferenza do Cas9 activo, o dCas9 carece de actividade endonuclease, o que o fai incapaz de inducir roturas de dobre cadea no ADN. Polo tanto, o dCas9 pódese usar para dirixirse con precisión a rexións específicas do xenoma sen ningún cambio ou modificación na secuencia do ADN (Wang et al., 2016). En dCas9, dúas proteínas endonuclease, RuvC e HNH, inactívanse ao suprimir importantes residuos de aminoácidos. (Richter et al., 2016). A pesar da súa falta de actividade de clivaxe do ADN, o dCas9 desempeña varios papeis importantes na investigación xenética e na biotecnoloxía. Por exemplo, permite a visualización de rexións específicas do xenoma, facilita a regulación transcricional e promove modificacións epixenéticas (Brocken et al., 2018).
O factor de transcrición ZEB1 (cinc finger E-box binding homeobox 1) desempeña un papel específico e crítico na mediación da transición epitelio-mesenquimal (TEM), un proceso celular que ocorre durante o desenvolvemento embrionario, a reparación de tecidos e a progresión do cancro. Implica a transformación de células epiteliais en células mesenquimais, o que resulta en cambios na morfoloxía celular, motilidade, invasividade, etc. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibe múltiples marcadores epiteliais, como a E-cadherina e a ocludina, que son responsables de manter a adhesión célula-célula e a polaridade das células epiteliais no TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Ademais, ZEB1 activa certos marcadores como a N-cadherina, a vimentina e a fibronectina (Konradi et al., 2014) e tamén regula xenes implicados na remodelación do citoesqueleto, como as Rho GTPases e as metaloproteinases de matriz (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), ademais, tamén afecta a varias vías de sinalización como o factor de crecemento transformante β (TGF-β), a sinalización Wnt, etc., promovendo así a invasión tumoral e a metástase no TNBC (Chen et al., 2016). Numerosos estudos e evidencias científicas indican que a ZEB1 ten un gran potencial como un axente valioso para a detección e intervención terapéutica do TNBC. Nun estudo recente, Waryah et al. utilizaron un modelo de TNBC e lograron a supresión completa de ZEB1 por dCas9. Así, observaron unha especificidade moi alta e unha inhibición case completa de ZEB1 en condicións in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 é unha ferramenta de edición de xenes chamada CRISPR/Cpf1. Deriva do sistema CRISPR/Cas, onde o termo Cas12 se refire á proteína 12 asociada a CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), que é completamente similar a Cas9. A única diferenza é que contén a proteína Cas12. En comparación con Cas9, Cas12 ten algunhas funcións únicas, como a xeración de extremos pegañentos durante o proceso de edición de xenes, mentres que Cas9 xera extremos romos (Wang et al., 2021). Esta propiedade de Cas12 contribúe á súa tecnoloxía específica de manipulación do ADN. Como proteína capaz de recoñecer e cortar con precisión o ADN diana, ten unha versatilidade extraordinaria, o que a converte nunha ferramenta eficaz para unha variedade de aplicacións, incluída a edición de xenes (Pickar-Oliver e Gersbach, 2019).
Do mesmo xeito que outras variantes de CRISPR, CRISPR/Cas12 tamén é capaz de eliminar ou activar xenes no TNBC, dirixíndose a xenes que desempeñan un papel importante na súa patoxénese ou resposta ao tratamento (Yang e Zhang, 2023). Para levar a cabo este proceso, desenvolveuse un ARN guía (gRNA) que dirixe Cas12 ao xene diana. Unha vez que Cas12 se une ao seu obxectivo, introduce roturas de dobre cadea no ADN e activa mecanismos de reparación do ADN. Durante o proceso de reparación, poden incorporarse nucleótidos incorrectos, o que leva a mutacións xénicas e perda de función (Zhang et al., 2021a). Ademais, tamén se utilizou unha versión mellorada do encima Cas12 (chamado dCas12) para activar xenes. Ao combinalo cun activador da transcrición, é posible inducir certos xenes, activándoos así. Esta tecnoloxía ten un gran potencial para promover a activación de xenes supresores de tumores (Sultan et al., 2022).
A edición con cebadores é unha tecnoloxía de edición xenómica recentemente desenvolvida e extremadamente superior. É capaz de modificar o ADN dun organismo con moita precisión (Chen e Liu, 2023). A edición con cebadores conséguese mediante a integración de dous compoñentes principais: un encima CRISPR/Cas9 modificado e unha transcriptase inversa. A función do encima CRISPR/Cas9 é dirixirse selectivamente a sitios precisos no xenoma, mentres que a transcriptase inversa axuda a modificar completamente o ADN na localización obxectivo (Hassan et al., 2021). No mecanismo de edición de cebadores, o primeiro paso implica a creación dun ARN guía de edición de cebadores (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Contén a secuencia obxectivo e o molde de ARN correspondente ao sitio de edición desexado no ADN obxectivo. O pegRNA introdúcese entón nas células obxectivo xunto cunha nuclease de edición de cebadores (PE2). A PE2 é unha proteína de fusión que consiste nun encima Cas9, unha transcriptase inversa e un adaptador de edición de cebadores (Martín-Alonso et al., 2021). Dentro da célula, os complexos de pegRNA e PE2 buscan o ADN específico que queren modificar. O encima Cas9 corta o ADN e crea un molde que consiste en cadeas simples (Choi et al., 2022). A transcriptase inversa usa este molde para preparar o ADN para a edición. Xunto coa copia do ADN, tamén se inclúen instrucións para editar o molde de ARN. Finalmente, a cadea de ADN recentemente creada úsase como molde para reparar a rotura no ADN, o que resulta nunha secuencia de ADN alterada que contén a modificación desexada (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Os mecanismos de edición de cebadores poden levar a mutacións xeneralizadas nos xenes. Pode dirixirse a mutacións puntuais, insercións, delecións e mesmo substitucións de xenes (Anzalone et al., 2019; Chen e Liu, 2023). A edición con cebadores ofrece varias vantaxes sobre as tecnoloxías anteriores de edición do xenoma. Estas inclúen unha maior precisión, unha redución dos efectos fóra do obxectivo e a capacidade de editar ADN sen depender das roturas de dobre cadea do ADN (Anzalone et al., 2020).
A tecnoloxía CRISPR/Cas9 desenvolveuse orixinalmente para protexer as bacterias da transferencia de plásmidos e da infección por fagos, e posteriormente reutilizouse como unha ferramenta eficaz de direccionamento do ADN baseada en ARN para a edición do xenoma (Jiang e Doudna, 2017). Ademais, informouse de que o sistema CRISPR/Cas9 está presente no 50 % e o 87 % dos xenomas bacterianos e arqueais, respectivamente (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 é unha ferramenta potencial para a eliminación, inserción e corrección de calquera secuencia xenética anormal utilizando os modos in vivo e in vitro (Sabit et al., 2021). Ademais, demostrouse que CRISPR/Cas9 forma parte do sistema inmunitario adaptativo debido á súa especificidade para os xenes diana de interese (Chen e Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 consta de Cas9 e un único ARN guía (sgRNA). Cas9 é unha endonuclease composta por múltiples compoñentes proteicos. Ademais, Cas9 ten propiedades estruturais e conformacionais únicas (Pacesa et al., 2022) xa que consta de dous lóbulos: recoñecemento (REC) e nuclease (NUC). O lóbulo REC divídese á súa vez en tres rexións: REC1, REC2 e hélices ponte (Cromwell et al., 2018). A NUC consta de tres lóbulos, concretamente RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH e o dominio de interacción do motivo adxacente ao protoespazador (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). O sgRNA consta de dous compoñentes, incluíndo o ARN CRISPR (crRNA) e o ARN pequeno transcodificante (ARN trazador) (Figura 1). O sgRNA conecta a proteína Cas9 ás conexinas para formar un complexo activo, tamén coñecido como complexo efector (Richter et al., 2012). O crRNA é un par de bases de 18 a 20 nucleótidos que desempeña un papel fundamental no recoñecemento das secuencias de ADN diana. Ademais, o crRNA emparéllase co ADN diana e o tracrRNA actúa como unha armazón para que a nuclease Cas9 se una ao ADN diana (Manghwar et al., 2019). Por outra banda, a secuencia PAM ten 3 nucleótidos, o que confirma, especifica e media a unión do complexo efector ao ADN. As subunidades RuvC e HNH do complexo proteico Cas9 teñen actividade catalítica (Richter et al., 2012; Asmamaw e Zawdie, 2021). O dominio da nuclease HNH da subunidade Cas9 cliva a cadea de ADN asociada co crRNA. O dominio da nuclease RuvC cliva outras febras de ADN e xera roturas de dobre febra (DSB), tras o cal se activan dous mecanismos diferentes de reparación de roturas de ADN (Jiang e Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Visión xeral de CRISPR/Cas9 (A). Compoñentes do sistema CRISPR/Cas9: (i). A endonuclease Cas9 é a responsable de cortar a secuencia de ADN diana, (ii) un único ARN guía (sg) resultante da fusión de quimeras crRNA e tra-crRNA. (dous). Cas9 inclúe varios compoñentes como Rec I, Rec II, lóbulo NUC (HNH e Ruv C son subcompoñentes) e dominio de interacción PAM (C) coas funcións correspondentes. O complexo proteico CRISPR/Cas9 cliva as secuencias de ADN en formas non complementarias e complementarias (D). CRISPR/Cas9 edita o xenoma en tres etapas: recoñecemento, corte e reparación. O ARN-sg deseñado guía a Cas9 e recoñece a secuencia desexada a través do compoñente complementario crRNA. Cas9 recoñece a secuencia PAM en 5'-NGG-3' e funde o ADN, formando un híbrido ADN-ARN e activando a clivaxe. O dominio HNH de Cas9 cliva a cadea complementaria e o dominio RuvC cliva a cadea non complementaria. CRISPR/Cas9 repara o ADN bicatenario rompéndoo de dúas maneiras: unión de extremos non homólogos (NHEJ) e reparación dirixida por homoloxía (HDR). A NHEJ repara o ADN bicatenario en ausencia de ADN homólogo alleo mediante un proceso encimático, un mecanismo propenso a erros que pode inserir ou eliminar secuencias de ADN aleatorias. A HDR é moi específica e require modelos de ADN homólogos.
As vías de reparación mediadas por CRISPR/Cas9 inclúen mecanismos de unión de extremos non homólogos (NHEJ) e reparación dirixida por homoloxía (HDR). A NHEJ é unha vía propensa a erros porque implica inserción ou deleción e non require ningún patrón durante o mecanismo de reparación. Usa nucleótidos aleatorios para xerar proteínas estándar (Abbasi et al., 2021). Este sistema de reparación consta de catro complexos, como o complexo KU, o complexo proteico de complementación cruzada tipo 4 (XRCC-4), o encima de procesamento de extremos do ADN e a proteína quinase ADN-PKcs (Abbasi et al., 2021). A proteína complexa KU ten dúas subunidades, Ku 70 e Ku ​​80, e desempeña un papel importante no mecanismo da NHEJ, xa que o mecanismo de reparación se inicia coa unión de dúas subunidades (Ku 70 e Ku ​​80) aos extremos romos ou case romos do ADN diana (Abbasi et al., 2021), servindo como armazón para recrutar outros factores relacionados coa NHEJ ao lugar da lesión (Yang et al., 2020). A XRCC-4 e a ADN ligase están compostas por 334 e 911 aminoácidos, respectivamente, e o complexo XRCC4-ADN ligase IV estimula a ligación dos extremos do ADN (Chatterjee et al., 2015). O encima de procesamento dos extremos do ADN, tamén coñecido como polinucleótido quinase 3'-fosfato, é un encima de procesamento dos extremos do ADN. Pode eliminar o grupo 3'P do ADN e fosforilar o grupo 5'OH durante a reparación da DSB. Tamén implica a reparación de roturas de cadea simple (SSB) usando a vía de reparación SSB (Chatterjee et al., 2015). A proteína quinase DNA-PKcs é unha proteína quinase dependente do ADN que consiste nunha subunidade catalítica das PIKK (quinases relacionadas coa fosfatidilinositol 3-quinase) e da familia das ataxia-telanxiectasia mutadas (ATM), así como das ATR relacionadas con ATM e Rad3, roturas de cadea (DSB) e roturas de cadea simple (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
A HDR é un mecanismo de reparación máis preciso e axeitado porque a información se copia usando a forma intacta do dúplex de ADN homólogo, aínda que require a presenza de cromátidas irmás. Isto ocorre durante a fase S/G2 do ciclo celular dos mamíferos. A HDR ocorre principalmente en especies de lévedos, pero a NHEJ é fundamental nos mamíferos (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). O mecanismo de reparación completo móstrase na Figura 1.
Dado que o tumor tumoral trigeminal (TNBC) está causado por anomalías xenéticas e epixenéticas, a corrección de anomalías xenómicas/epixenómicas malignas mediante CRISPR/Cas9 pode ser unha estratexia terapéutica razoable (Chen et al., 2019). Ademais, algúns factores de transcrición implicados na regulación transcricional específica de células poden presentar características únicas das células cancerosas, o que suxire que a regulación transcricional pode ser unha excelente estratexia para o tratamento do cancro (Drost et al., 2017). A explotación destas características moleculares dos tumores, como os defectos xenéticos, epixenéticos e transcricionais, para o desenvolvemento de fármacos pode mellorar os resultados clínicos e reducir os custos de cribado. CRISPR é unha ferramenta potencial de edición de xenes que non só pode detectar e identificar dianas xenómicas causantes de cancro, senón que tamén se pode usar para editar, suprimir e modificar epixeneticamente oncoxenes en células humanas (Táboa 1) (Ahmed et al., 2021). Realizáronse varias probas de cribado CRISPR para buscar xenes asociados con supresores tumorais, oncoxenes e resistencia a fármacos. O uso de CRISPR/Cas9 para editar varios oncoxenes de TNBC móstrase na Figura 2.
Figura 2. Edición xenética de varios oncoxenes de TNBC usando CRISPR/Cas9, o que resulta nunha redución do crecemento tumoral e da metástase. Estes oncoxenes inclúen CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 e CXCR7, Crypto1, ROR1 e ST8SIA, que están implicados na aparición e metástase do TNBC.
A migración, a invasión e a transición epitelio-mesenquimal (TEM) das células cancerosas están asociadas con ITGA9. Estudos previos demostraron que ITGA9 é un actor clave na vía Notch e desempeña un papel interesante na metástase do rabdomiosarcoma (Molist et al., 2020). Ademais, descubriuse que ITGA9 está estreitamente asociado co prognóstico dos pacientes en varios tipos de tumores, incluído o cancro de mama (Wang Z. et al., 2019). Ademais, a análise bioinformática de ITGA9 mostrou que a súa expresión no TNBC era significativamente maior que noutros subtipos de cancro de mama. Os niveis elevados de ITGA9 están asociados coa metástase tumoral e a recaída en pacientes con TNBC. A eliminación de ITGA9 por CRISPR/Cas9 resultou en propiedades similares ás das células nai cancerosas (CSC), anxioxénese tumoral, crecemento tumoral e metástase reducida ao promover a degradación da β-catenina no TNBC (Wang Z. et al., 2019).
A cripto-1 é un membro da familia TGF-β e é fundamental para a embrioxénese temperá, o mantemento das células nai e a metástase do cancro (Ishii et al., 2021). Tamén coñecida como Tdgf-1, é unha proteína de sinalización oncoxénica ancorada a GPI implicada na regulación da formación da estría primitiva, o mesoderma e o endoderma, así como no establecemento da asimetría esquerda/dereita no desenvolvemento dos órganos do corpo durante a embrioxénese (Zhang et al., 2021b). Ademais, demostrouse que a cripto-1 está implicada na transición epitelio-mesenquimal (TEM) como marcador de células nai (Zhang et al., 2021b). A TEM é fundamental non só para varios procesos como o desenvolvemento embrionario, a fibrose e a cicatrización de feridas, senón tamén para a invasión e a metástase do cancro. Ademais, demostrouse que a cripto-1 interactúa con catro receptores Notch e mellora a súa maduración postraduccional (Brandstadter e Maillard, 2019). Sábese que a vía de sinalización Notch está implicada no mantemento das células de cancro de mama humano. Os estudos demostraron que a eliminación mediada por CRISPR/Cas9 de Crypto-1 suprime o crecemento e a metástase do cancro. Polo tanto, Crypto-1 pode converterse nun importante obxectivo terapéutico para o TNBC (Castro et al., 2015).
A proteína XCL12 e o seu receptor de quimiocinas CXC (CXCR4 e CXCR7) desempeñan varios papeis na proliferación, crecemento, migración e invasión das células cancerosas (Wu et al., 2015). Estes quimiorreceptores foron asociados co desenvolvemento do cancro de mama tripla (TNBC) a través de múltiples vías de sinalización tanto en modelos in vivo como in vitro (Wu et al., 2015). Ademais, a activación de CXCR4 e CXCR7 está asociada a unha maior susceptibilidade á metástase e a un mal prognóstico no TNBC (Karn et al., 2022). Polo tanto, a eliminación de CXCR4 e CXCR7 pode converterse en xenes diana farmacolóxicos eficaces para o tratamento do cancro de mama, incluído o TNBC. Un estudo de Yang et al. (2019) utilizou CRISPR/Cas9 para eliminar conjuntamente os xenes CXCR4 e CXCR7 e descubriu que a proliferación, o crecemento, a migración e a invasión do TNBC estaban significativamente inhibidas (Yang et al., 2019).
Observáronse niveis elevados de miR-3662, un oncoxene do cancro de mama tripla (TNBC), nos tecidos do cancro de mama (Yi et al., 2022). Demostrouse que a inhibición de miR-3662 inhibe o crecemento e a metástase do tumor de cancro de mama tanto in vivo como in vitro (Agarwal e Gupta, 2021). A HBP-1 é un potente inhibidor da sinalización Wnt/-catenina e probablemente sexa responsable do crecemento das células TNBC mediado por miR-3662. Recentemente, Yi et al. descubriron que o eixe miR-3662-HBP1 regula a vía de sinalización Wnt/-catenina nas células TNBC (Yi et al., 2022). Debido á súa expresión específica do tumor, o miR-3662 pode ser un posible obxectivo terapéutico para o TNBC. Polo tanto, a inhibición de miR-3662 mediada por CRISPR/Cas9 pode ser un excelente enfoque para desenvolver novos fármacos para o tratamento do TNBC.
A UBR5 é unha nucleofosfoproteína de 300 kDa que foi identificada como un regulador clave da tumorexénese, a metástase e a resposta inmunitaria en varios tipos de cancro (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Informouse de que a UBR5 está moi regulada á alza en mostras de TNBC e estimula a función de ERα ao inducir a proliferación a través da súa actividade de ubiquitina ligase (Bolt et al., 2015). Os estudos de secuenciación do exoma completo de mostras primarias de TNBC tamén mostraron unha maior expresión de UBR5, o que suxire o seu papel no desenvolvemento do TNBC. Ademais, a deleción de UBR5 impulsada por CRISPR/Cas9 mostrou unha inhibición significativa da metástase e o crecemento do TNBC en modelos experimentais de rato. Por outra banda, a inclusión de UBR5 nun modelo de rato de tipo salvaxe restaurou a súa funcionalidade completa, mentres que este efecto non se observou en cepas mutantes inactivadas (Liao et al., 2017). A falta de UBR5 está asociada a un aumento da apoptose, necrose e inhibición do crecemento tumoral no TNBC debido a unha anxioxénese deficiente. Debido á perda de UBR5, a propagación tumoral a órganos distantes redúcese e a UBR5 induce a EMT anormal principalmente ao reducir a expresión de E-cadherina (Zhang e Weinberg, 2018). Recentemente, demostrouse que a UBR5 é un factor moi importante na transcrición de PDL1 inducida por IFN-γ no TNBC debido á súa falta de actividade de ubiquitinación de E3. A análise do transcriptoma de ARN revelou que a UBR5 pode ter efectos sistémicos sobre os xenes asociados coa vía do IFN-γ e promover a transactivación de PDL1 ao aumentar os niveis de activación do ARN da proteína quinase (PKR) e os seus transdutores e activadores de sinal, a transcrición 1 (STAT1) e o factor regulador do interferón 1 (IRF1). Non obstante, a ablación combinada mediada por CRISPR/Cas9 da expresión de UBR5 e PD-L1 ten un efecto terapéutico sinérxico que calquera dos bloqueos por si só, con profundos efectos no microambiente tumoral (Wu et al., 2022). Polo tanto, CRISPR/Cas9 pode ser unha ferramenta importante para inhibir a función de UBR5, suprimindo así a metástase dos TNBC e o crecemento tumoral.
A ROR1 é unha proteína transmembrana de tipo I que se expresa durante o cancro e o desenvolvemento embrionario e foi identificada como unha proteína oncofetal (Nicholas Borcherding, 2014). O comportamento invasivo de varios cancros humanos está asociado á regulación á alza de ROR1. Obtivéronse resultados prometedores de estudos in vivo e in vitro con compostos terapéuticos dirixidos a ROR1 (Chien et al., 2016). Os niveis elevados de ARNm de ROR1 en biopsias de tecido mamario tamén se asociaron con tumores agresivos de mama de tipo basal (BL) e a súa migración a outras partes do corpo. Ademais, a sobreexpresión de ROR1 identificouse como un marcador prognóstico para o desenvolvemento de TNBC (Chien et al., 2016). Non obstante, silenciar ROR1 usando CRISPR/Cas9 para suprimir o crecemento e a metástase de TNBC sería unha estratexia eficaz.
O proceso de sialilación implica a adición de ácido siálico aos glicoconxugados, o que é catalizado por sialiltransferases (ST). ST8SIA1 pertence á familia ST e desempeña un papel importante na patoxénese de diversas enfermidades como a leucemia linfocítica e o cancro colorrectal (Chang et al., 2018). A análise da secuencia de ARN mostra que ST8SIA1 exprésase en gran medida no tecido mamario de pacientes con TNBC e está positivamente correlacionado con mutacións no xene supresor tumoral p53, o que pode contribuír á patoxénese do TNBC (Battula et al., 2017). Ademais, ST8SIA1 está implicado na metástase e recorrencia do TNBC, o que suxire que desempeña un papel importante na aparición e desenvolvemento do TNBC. Nun modelo in vitro de TNBC, demostrouse que a inhibición de ST8SIA1 por CRIPSR/Cas9 bloquea o crecemento e a metástase (Battula et al., 2017). Isto suxire que CRISPR/Cas9 pode ser unha ferramenta importante para inhibir a función do oncoxene ST8SIA1 no tratamento do TNBC.
A NAT1 é unha encima metabólica que cataliza a formación de compostos xenobióticos de fase II e exprésase en case todos os tecidos humanos. A NAT1 pode usar o cofactor folato para atacar o acetil-CoA (acetil-CoA) mesmo en ausencia do substrato de amina aromática (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Os estudos demostraron que a NAT1 regula a función da metaloproteinase de matriz 9 (MMP9) en modelos de células de cancro de mama e protexe contra as especies reactivas de osíxeno (ROS) durante a inanición de glicosa (Wang et al., 2018). Demostrouse que a eliminación de NAT1 inhibe o complexo da piruvato deshidroxenase, o que leva á disfunción mitocondrial (Wang L. et al., 2019). Ademais, varios outros informes demostraron que a inhibición de NAT1 mediante moléculas pequenas e silenciamento de siRNA pode reducir a invasividade e a proliferación das células de cancro de mama (Stepp et al., 2018). Recentemente, CRISPR/Cas9 empregouse para suprimir NAT1 na liña celular de cancro de mama MDA-MB-231, o que afecta o metabolismo celular dependendo do seu nivel de expresión. Este estudo tamén mostrou que NAT-1 é fundamental para a progresión e metástase do TNBC (Carlisle et al., 2020).
A transcrición coordinada de oncoxenes está regulada por superpotenciadores, factores de transcrición e cofactores (Hnisz et al., 2015). Ademais, un grupo de quinases dependentes de ciclinas (CDK), como CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 e CDK13, son necesarias para a regulación transcricional. Entre elas, a CDK7 está implicada na fosforilación da ARN polimerase II, que é moi importante para o inicio e a expansión da transcrición de oncoxenes na patoxénese do TNBC. Nun estudo fundamental, a deleción de CDK7 por CRISPR/Cas9 inhibiu o TNBC, o que indica que a patoxénese do TNBC depende de CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Os estudos demostraron que as mutacións en MYC e RBP (proteína de unión ao ARN) poden levar á apoptose, mentres que as mutacións dun só xene en MYC ou RBP non afectan o crecemento das células cancerosas (Einstein et al., 2021). Examináronse máis de 1000 RBP no xenoma humano usando unha biblioteca baseada en CRISPR/Cas9. Entre elas, descubriuse que 57 RBP son fundamentais para o crecemento de células cancerosas con niveis de MYC moi elevados (Wheeler et al., 2020). Ademais, o YTHDF2 é importante para manter o crecemento das células TNBC e reduce a cantidade de transcritos metilados durante a transcrición e tradución de alto nivel en células cancerosas con maior expresión de MYC. Ademais, o YTHDF2 non é esencial para as células cancerosas, que dependen menos dos niveis elevados de MYC para prolongar a supervivencia dos pacientes con TNBC (Einstein et al., 2021), o que suxire que pode ser un posible obxectivo terapéutico para fármacos que poden superar o TNBC.
As proteínas con dedos de zinc (ZNF) constitúen aproximadamente o 1 % do xenoma humano total. Algúns estudos demostraron que o ZNF pode regular a proliferación celular en varios tipos de cancro, como o cancro de fígado, o cancro de mama e o cancro colorrectal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). As bibliotecas xeradas mediante a eliminación de CRISPR utilizáronse para cribar varios xenes supresores tumorais (TSG) en células de cancro de mama (Shalem et al., 2014). Desde entón, un estudo transcriptómico de células de cancro de mama con deleción de ZNF319 en CRISPR/Cas9 demostrou que o ZNF319 é ​​un xene supresor tumoral que reduce a proliferación do cancro de mama e, polo tanto, está implicado en varios mecanismos de sinalización potenciais e outras funcións biolóxicas (Wang L. et al., 2022).
A ferroptose é un tipo de morte celular programada que depende da presenza de ferro. Sábese que o desenvolvemento da ferroptose está influenciado pola presenza de peróxidos lipídicos. Ademais, informouse de que a PKCβII presenta unha peroxidación lipídica temperá e que o aumento da peroxidación lipídica está asociado á ferroptose. A selección dunha biblioteca de inhibidores de quinase mediados por CRISPR/Cas9 revelou que a PKCβII está implicada no proceso de peroxidación lipídica, que é fundamental para a ferroptose nas células MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Polo tanto, isto suxire que a eliminación de PKCβII por CRISPR/Cas9 pode ser un posible obxectivo xénico supresor tumoral para o tratamento de enfermidades relacionadas coa ferroptose (Zhang et al., 2022).
Crese que a resistencia aos fármacos é responsable de aproximadamente o 90 % das mortes en pacientes con cancro e é un dos principais desafíos no tratamento do cancro (Bukowski et al., 2020). Os resultados indican que un número suficiente de xenes relacionados co fluxo de fármacos, a reparación do ADN, a apoptose e varias vías de sinalización celular están asociados coa resistencia aos fármacos (Haider et al., 2020). Entre eles, varios xenes foron obxectivo das ferramentas CRISPR/Cas9 e mostraron resultados prometedores na redución da resistencia aos fármacos e no aumento da eficacia dos tratamentos anticanceríxenos (Vaghari-Tabari et al., 2022). Ademais, as bibliotecas de cribado de alto rendemento con eliminación do xene CRISPR/Cas9 foron implicadas na modificación da función de posibles dianas de xenes de resistencia aos fármacos (Shalem et al., 2015). Para identificar os xenes de resistencia ao paclitaxel, utilizouse a secuenciación de ARN xunto coa selección de bibliotecas de sgRNA de todo o xenoma para identificar oito xenes candidatos, incluída a histona desacetilase 9 (HDAC9), que están asociados coa resistencia aos fármacos en pacientes con TNBC recorrente (B et al., 2020). Noutro estudo, observouse un aumento da expresión da diserina/treonina e da proteína quinase da tirosina (DSTYK) durante a supervivencia de pacientes con TNBC tratados con fármacos anticanceríxenos. Ademais, a inhibición de DSTYK mediada por CRISPR/Cas9 aumentou significativamente a apoptose das células cancerosas resistentes aos fármacos in vitro (células SUM102PT e células MDA-MB-468) e un modelo de TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Aínda que o TNBC presenta unha activación anormal da vía MAPK, o efecto clínico das terapias dirixidas a MEK é deficiente. Unha selección da biblioteca xenómica CRISPR/Cas9 revelou que a inhibición de PSMG2 (chaperona 2 do ensamblaxe do proteoma) sensibiliza as células TNBC BT549 e MB468 ao inhibidor de MEK AZD6244. A inhibición de PSMG2 por CRISPR/Cas9 alterou a función normal do proteasoma, o que levou ao desensamblaxe mediado por autofaxia de PDPK1, mellorando así aínda máis as células tumorais en modelos de ratos TNBC inducidos por AZD6244 (inhibidor de MEK) e MG132 (inhibidor do proteasoma). Polo tanto, os inhibidores do proteasoma e da quinase MAP (MEK) poden administrarse sinerxicamente para reducir a proliferación de células tumorais (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 tamén se empregou para detectar a perda da función xénica que leva á resistencia ao TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. explicaron o mecanismo de resistencia aos fármacos das células cancerosas tratadas con JQ1, un inhibidor do bromodominio BET (BBDI), no TNBC. Usando CRISPR/Cas9, descubriron que a eliminación do xene rb1 provocaba que o TNBC se volvese resistente ao fármaco anticanceríxeno JQ1. Polo tanto, a función rb1 é importante na resposta aos fármacos JQ1 no TNBC. Tamén informaron de que o paclitaxel é un inhibidor da quinase/microtúbulos CDK4/6, e a súa combinación con BBDI como JQ1 pode proporcionar respostas terapéuticas prometedoras ao TNBC resistente aos fármacos (Ge et al., 2020).
Informouse de que a paisaxe transcricional do ARN longo non codificante (ARNlnc) é responsable da resistencia á terapia neoadxuvante no TNBC. Este estudo mostra que cinco transcritos diferentes de ARNlnc de MALAT1 están altamente expresados ​​no TNBC. Ademais, a deleción de MALAT1 mediada por CRISPR/Cas9 aumentou a sensibilidade das células BT-549 do TNBC ao paclitaxel e á doxorrubicina, o que suxire un posible papel para a resistencia a MALAT1 no TNBC (Shaath et al., 2021).
As mutacións en BRCA1 (BRCA1m) son heteroxéneas e, polo tanto, difíciles de detectar. A focalización de PARP1 (poli(ADP-ribosa) polimerase), o compañeiro letal sintético de BRCA1, pode aumentar a quimiosensibilidade aos fármacos para o TNBC. Usando CRISPR/Cas9, a deleción de PARP1 aumentou a sensibilidade dos fármacos anticanceríxenos como a doxorrubicina, a xemcitabina e o docetaxel ás células TNBC mutantes de mBRCA1, o que suxire que PARP1 tamén está implicada na resistencia aos fármacos no TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Sábese que as mutacións nos xenes supresores tumorais BRCA1 ou BRCA2 aumentan a probabilidade de desenvolver cancro de mama nas persoas. O tratamento destas pacientes require o uso de inhibidores de PARP. Ademais, demostrouse que a eliminación do factor de rescate de nucleótidos DNPH1 mediante CRISPR/Cas9 pode eliminar o nucleótido tóxico 5-hidroximetildesoxiuridina (hmdU) monofosfato, mellorando así a resposta das células con deficiencia de BRCA á sensibilidade aos inhibidores de PARP (Fugger et al., 2021). Polo tanto, os inhibidores de CRISPR/Cas9 e PARP1 poden converterse nunha importante estratexia de tratamento para o TNBC.
O xene da glicoproteína penetrante (P-gp) é un xene de resistencia a múltiples fármacos que xeralmente está regulado positivamente en aproximadamente o 41 % de todos os tumores de mama tripla (TNBC) (Sun et al., 2020). O fluxo de fármacos inducido por P-gp identificouse como un regulador clave da resistencia aos fármacos no cancro de mama. Os inhibidores da P-gp demostraron unha maior sensibilidade aos fármacos anticanceríxenos no cancro de mama (Famta et al., 2021). Polo tanto, a ablación ou supresión mediada por CRISPR/Cas9 da P-gp e os inhibidores da P-gp poden ser métodos moi importantes para superar a resistencia aos fármacos no TNBC.
Sábese que o transportador de casete de unión a ATP G2 (ABCG2) causa resistencia a fármacos no TNBC (Palasuberniam et al., 2015), aínda que actualmente non hai informes sobre a relación entre o silenciamento de CRISPR/Cas9 e ABCG2 e a inactivación do xene supresor tumoral. O PTEN pode mellorar a activación de ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015) (Deepak Singh et al., 2021). Polo tanto, o uso de CRISP/Ca9 para eliminar ABCG2 e combinalo cun inhibidor de ABCG2 pode ser un tratamento axeitado para superar a resistencia a fármacos no TNBC. A táboa 2 menciona que CRISPR/Cas9 se dirixe a todos os xenes de resistencia.
Táboa 2. CRISPR/Cas9 ten como obxectivo varios xenes de resistencia a TNBC para sensibilizar as células aos fármacos anticanceríxenos.
As bibliotecas CRISPR/Cas9 son ferramentas potenciais para a detección de mutacións xenéticas asociadas coa patoxénese do cancro (Chan et al., 2022). Este método de detección implica catro pasos, como (a) construción da biblioteca, (b) transdución lentiviral, (c) detección fenotípica e (d) análise do xene diana. Aínda que o TNBC ten unha activación anormal da vía MAPK, o prognóstico clínico da terapia dirixida a MEK para pacientes con TNBC portadores de mutacións en xenes supresores tumorais como PTEN, RB1 e TP53 é moi malo.
Ademais, unha proba de eliminación de xenes empregando CRISPR/Cas9 probou a molécula máis potente e selectiva, o deshidrocatrol, que abunda nos extractos de flores e follas de Guatemala, para comprender o efecto do deshidrocatrol sobre o MDA-MB-231. Mecanismos de citotoxicidade celular selectiva. Características do talo mesenquimal dos subtipos de TNBC. Esta proba baseada en CRISPR/Cas9 tamén revelou que o HSD17B11, un xene que codifica a 17β-hidroxiesteroide deshidroxenase tipo 11, exprésase en gran medida nas células MDA-MB-231 e produce deshidrofalcarinol específico para as células MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Polo tanto, isto suxire que a proba xenómica de CRISPR/Cas9 ten un gran potencial para identificar os mecanismos subxacentes ás propiedades anticanceríxenas de posibles compostos naturais.
Ademais, estudouse a vulnerabilidade do TNBC ao cancro mediante unha proba CRISPR/Cas9 in vivo imparcial a nivel xenómico, que mostrou unha relación entre as vías oncoxénicas e supresoras tumorais. Informouse de que os compoñentes clave das vías mTOR e Hippo desempeñan papeis importantes na regulación tumoral no TNBC. Ademais, os estudos demostraron que a inhibición farmacolóxica da oncoproteína mTORC1/2 e YAP inhibe eficazmente a patoxenicidade do TNBC utilizando un modelo de sinerxia fármaco-matriz in vitro e xenoenxertos derivados de pacientes in vivo. Por outra banda, a inhibición de mTORC1/2 mediada por Torin-1 mellora a macropinocitose, mentres que a inhibición de YAP inducida por verteporfina leva á morte celular do TNBC. En conxunto, estes resultados destacan o poder e a robustez da proba CRISPR in vivo a nivel xenómico para identificar tratamentos novos e eficaces para o TNBC (Dai et al., 2021).
A desregulación do sistema inmunitario é un factor importante na tumorexénese. As células cancerosas evaden a eliminación inmunitaria ao ignorar os mecanismos de defensa, como interferir coa actividade das células inmunitarias no microambiente tumoral e comprometer o sistema inmunitario. Polo tanto, o desenvolvemento dun sistema inmunitario mellorado pode ser unha estratexia clave para combater os tumores. O uso da modificación xénica baseada en CRISPR/Cas9 aborda varios problemas relacionados coa disfunción inmunitaria desde diferentes perspectivas. CRISPR/Cas9 utilizouse para mellorar a inmunidade antitumoral contra o cancro de mama a través das seguintes vías (Figura 3).
Figura 3. A inmunoterapia CRISPR/Cas9 ten como obxectivo as células TNBC. A perda de CDK5 e a supresión de PDL1 e CD155 potencian o sistema inmunitario. Do mesmo xeito, a perda de A2AR e a supresión de TAA como HER2, mucina 1 e TEM8 aumentaron a eficiencia das células CAR-T na destrución de células cancerosas. A selección de células T impulsada por CRISPR/Cas9 demostrou que a alteración da quinase p38 potencia a actividade antitumoral das células T. As células T modificadas por CRISPR/Cas9 aumentan a expresión de TCR (receptor das células T), o que resulta en células T con actividade antitumoral.
O obxectivo da inmunoterapia é estimular o sistema inmunitario para que ataque as células cancerosas. A sobreexpresión de proteínas de puntos de control inmunitarios adoita previr as reaccións autoinmunes, pero pode axudar aos cancros a evitalas (Topalian et al., 2015). Estas proteínas previnen as reaccións inmunitarias ao unirse a receptores na superficie das células inmunitarias. Múltiples proteínas de puntos de control (como CD155 e PD-L1) diríxense ao receptor PD-1 nas células inmunitarias e exprésanse no cancro de mama, especialmente no cancro de mama tripla (TNBC) (Li Y.-C. et al., 2020). A inhibición de PD-L1 ou do seu receptor mediante CRISPR/Cas9 pode estimular o sistema inmunitario para que ataque os tumores de TNBC (Yahata et al., 2019). Ademais, demostrouse que a regulación á baixa da expresión de PD-L1 mediante a eliminación mediada por CRISPR/Cas9 de CDK5 inhibe o crecemento tumoral in vitro e in vivo (Deng et al., 2020). A inhibición do crecemento en modelos in vitro e in vivo de cancro de mama suxire que a redución de CD155 mediada por shRNA pode ter un efecto terapéutico sobre o cancro de mama (Gao et al., 2018).
As células T CAR expresan CAR que recoñecen antíxenos asociados a tumores (TAA) e poden usar a supresión de proteínas de punto de control para mellorar a súa actividade (Li C. et al., 2020). Existen varios obxectivos potenciais para a terapia con células T CAR no cancro de mama, incluíndo varios TAA como HER2, mucina1 e TEM8 (Bajgain et al., 2018). Hai evidencia de que as células T CAR dirixidas á mesotelina (sobreexpresada en células TNBC BT-459) son máis eficaces contra o cancro cando se elimina PD-1 usando CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Non obstante, illar as células T dos pacientes e logo editalas ex vivo é un proceso que require moito traballo e tempo. Aínda que as células T universais poden reducir os requisitos de illamento, as células T doantes que expresan o antíxeno leucocitario humano (HLA clase I) e o receptor de células T (TCR) deben eliminarse para evitar anomalías do enxerto contra o hóspede (Ren et al., 2017, 2017a). Usando CRISPR/Cas9, a HDR pode eliminar simultaneamente o TCR e o HLA e eliminar o xene que codifica a CAR. Os estudos demostraron que CRISPR/Cas9 pódese usar para introducir CAR anti-CD19 no locus do TCR, producindo así CAR de forma eficiente sen esgotar as células T (Dimitri et al., 2022). Desenvolvéronse tecnoloxías multiplex para xerar células T CAR alóxenas eliminando simultaneamente o TCR, a beta-2-microglobulina (B2M), a subunidade HLA-I e outras proteínas como a PD-1 e a CTLA-4, que poden ter maiores propiedades anticanceríxenas contra o TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
O uso de CRISPR/Cas9 podería mellorar a eficacia das células CAR-T. Sábese que a adenosina ten propiedades inmunosupresoras e pode reducir a inmunidade anticanceríxena ao bloquear a función das células T e activar os receptores de adenosina A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). O silenciamento de A2AR mediante CRISPR/Cas9 mellorou significativamente a eficacia das células CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Sábese que as células T presentan varias características fenotípicas como a expansión celular, a diferenciación, o estrés oxidativo e o estrés xenómico. A detección de células T baseada en CRISPR/Cas9 revelou a alteración de 25 quinases receptoras de células T diferentes. Entre elas, demostrouse que a eliminación da quinase p38 mellora a actividade antitumoral das células T, o que indica que a quinase p38 é un regulador clave da regulación das células CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
As células T poden modificarse xeneticamente usando CRISPR/Cas9 para producir TCR altamente expresados. A transferencia de células T modificadas xeneticamente a pacientes demostrou unha maior actividade anticanceríxena que as células T endóxenas. Polo tanto, os TCR endóxenos poden competir cos TCR alterados xeneticamente nos pacientes, o que pode afectar o potencial da inmunoterapia contra o cancro. Para superar este problema, o uso de CRISPR/Cas9 para eliminar o TCR-β endóxeno nas células receptoras e posteriormente transferir células T TCR-β a pacientes con cancro pode exhibir mellores respostas inmunitarias anticanceríxenas sen necesidade de competencia sexual endóxena contra o TCR (Fan et al. 2018). Así, coa excepción das células T modificadas con CRISPR, as TCR son mil veces máis sensibles aos antíxenos tumorais que as células T transducidas por TCR normais. Ademais, en varias leucemias, as células T alteradas xeradas por CRISPR con TCR γδ mostran unha maior expresión de células T CD4+ e CD8+ que a transferencia estándar de TCR (Legut et al., 2018). Polo tanto, as células T modificadas xeradas por CRISPR/Cas9 poden ser un método de inmunoterapia eficaz para superar o TNBC.
As integrinas son moléculas de adhesión celular presentes nas transmembranas celulares que promoven a unión das células á matriz extracelular (MEC) (Hamidi e Ivaska, 2018). A desregulación das integrinas está asociada co desenvolvemento e a migración do cancro ao alterar a matriz extracelular, o que leva á supervivencia das células cancerosas na circulación (Hamidi e Ivaska, 2018). A supresión da integrina mediada por CRISPR/Cas9 ralentiza a progresión tumoral, a metástase e a colonización no TNBC. Informouse de que a supresión da integrina a5 (ITGA5) reduce a migración e a progresión celular noutros cancros como o cancro de pulmón (Ju et al., 2017), o que suxire que a integrina a5 tamén pode ser un factor clave na patoxénese do TNBC.
A xeración de ratos knockout mediante métodos tradicionais de células nai embrionarias (ES) é un proceso laborioso, lento e ineficiente. Leva meses e anos dirixirse ás células ES mediante recombinación homóloga, criar ratos quiméricos e logo cruzalos con ratos heterocigotos para producir descendencia homocigota. É necesario un cruzamento complexo para crear ratos con múltiples mutacións xenéticas. Non obstante, xurdiron moitos problemas ao usar ratos xerados por ablación de células ES mediante CRISPR/Cas9 ou mediante microinxección de compoñentes CRISPR/Cas9 en óvulos fertilizados unicelulares. Por exemplo, a introdución de cambios adoita ocorrer en loci bialélicos e non é específica dun xene. Recentemente informouse de que as células ES que usan a tecnoloxía CRISPR/Cas9 poden inserir simultaneamente mutacións bialélicas en ata 5 xenes (Nishizono et al., 2021). Para este propósito, o ARNm de Cas9 e cinco ARNg específicos de xenes foron transfectados simultaneamente en células ES. Isto destaca a promesa e a eficacia deste procedemento, aínda que estas mutacións puideron transmitirse cando se cruzaron liñas fundadoras para producir ratos quíntuplos knockout. O estudo tamén informa dun descubrimento sorprendente: as células ES xa non son necesarias para crear ratos modificados xeneticamente. No seu lugar, para eliminar produtos xénicos específicos, inxectáronse ARNm e ARNg Cas9 en embrións en estadio unicelular. Como resultado, creáronse liñas fundadoras knockout que teoricamente se poden usar para estudar as consecuencias da eliminación de xenes en ratos (Qin et al., 2016). Así, CRISPR/Cas9 permite a creación de ratos transxénicos para tratar o TNBC a un custo menor que a enxeñaría xenética tradicional. Usando o sistema CRISPR/Cas, desenvolveuse un novo modelo de rato knockout que pode introducir con éxito mutacións puntuais nun ou máis xenes endóxenos no TNBC. Baseándose neste concepto, tamén se poden desenvolver modelos animais de TNBC usando a deleción mediada por CRISPR/Cas9 de BRCA1 e p53, o que resulta na perda da reparación HR, inestabilidade xenómica e fenotipos mutantes (Annunziato et al., 2020).
Actualmente, utilízanse varios métodos como a mamografía, a resonancia magnética (RM) e a ecografía para diagnosticar o TNBC. Non obstante, estes métodos teñen algunhas limitacións. A mamografía utilízase para diagnosticar tecido mamario local en lugar de metástases, onde as células cancerosas migraron a outros órganos. A ecografía non é un método fiable para diagnosticar o TNBC (Chen e Lee-Felker, 2023). A RM ten unha maior sensibilidade que a ecografía e a mamografía, pero a súa precisión diagnóstica é limitada (Sha e Chen, 2022). A biopsia de tecido é unha forma invasiva de identificar as células cancerosas. Non obstante, nalgúns casos, unha biopsia pode pasar por alto tecido canceroso se a agulla se afasta da área de interese. Ademais, é moi cara e pode ser traumática para a paciente. O TNBC é un tipo heteroxéneo de cancro, polo que unha biopsia pode non proporcionar información suficiente sobre o tipo de cancro. Polo tanto, necesítase urxentemente un novo método diagnosticamente fiable para detectar o TNBC. CRISPR/Cas9 pode servir como unha alternativa altamente sensible e minimamente invasiva para o diagnóstico do cancro de mama. Con este fin, as estratexias baseadas en CRISPR/Cas9 poden empregarse para mellorar os métodos de PCR para o diagnóstico do TNBC. En primeiro lugar, as proteínas Cas9 e cpf1 do sistema CRISPR úsanse para eliminar o ADN non específico e, a continuación, estas dúas proteínas (Cas9 e cpf1) poden recoñecer a secuencia PAM antes de unirse ao ADN diana (Deepak Singh et al., 2021). Así, a PCR pode identificar mutacións asociadas co desenvolvemento do cancro. Varios estudos adoptaron esta estratexia baseada en CRISPR para detectar diferentes mutacións en diferentes tipos de cancro (Safari et al., 2019). Polo tanto, os métodos de PCR baseados en CRISPR poden reducir a dependencia do diagnóstico do TNBC de métodos invasivos como a inmunohistoquímica baseada en biopsias.
Tamén se demostraron cambios xenotípicos na regulación dos receptores hormonais no TNBC (Chen e Russo, 2009). As estratexias de PCR baseadas en CRISPR/Cas9 que empregan microarrays para diagnósticos no punto de atención poden monitorizar eficazmente estas mutacións (Hajian et al., 2019). Tamén podería proporcionar aos profesionais sanitarios información relevante sobre mutacións específicas en pacientes con TNBC, o que podería axudar a mellorar o seu tratamento. Non obstante, esta técnica combinada ten limitacións. Polo tanto, requírense amplos esforzos de investigación antes de que este método CRISPR/Cas-PCR se poida usar na atención sanitaria para o diagnóstico do TNBC (Yang et al., 2019).