O diagnóstico diferencial dos nódulos pulmonares identificados mediante tomografía computarizada (TC) segue sendo un reto na práctica clínica.Aquí, caracterizamos o metaboloma global de 480 mostras de soro, incluíndo controis sans, nódulos pulmonares benignos e adenocarcinoma pulmonar en estadio I.Os adenocarcinomas presentan perfís metabolómicos únicos, mentres que os nódulos benignos e os individuos sans teñen unha gran semellanza nos perfís metabolómicos.No grupo de descubrimento (n = 306), identificouse un conxunto de 27 metabolitos para diferenciar entre nódulos benignos e malignos.O AUC do modelo discriminante nos grupos de validación interna (n = 104) e validación externa (n = 111) foi de 0,915 e 0,945, respectivamente.A análise da vía revelou un aumento dos metabolitos glicolíticos asociados á diminución do triptófano no soro do adenocarcinoma pulmonar en comparación cos nódulos benignos e os controis sans, e suxeriu que a captación de triptófano promove a glicólise nas células do cancro de pulmón.O noso estudo destaca o valor dos biomarcadores de metabolitos séricos para avaliar o risco de nódulos pulmonares detectados por TC.
O diagnóstico precoz é fundamental para mellorar as taxas de supervivencia dos pacientes con cancro.Os resultados do ensaio nacional de detección do cancro de pulmón dos Estados Unidos (NLST) e do estudo europeo NELSON demostraron que o cribado con tomografía computarizada de baixa dose (LDCT) pode reducir significativamente a mortalidade por cancro de pulmón en grupos de alto risco1,2,3.Desde o uso xeneralizado da LDCT para a detección do cancro de pulmón, a incidencia de achados radiográficos incidentais de nódulos pulmonares asintomáticos continuou aumentando 4 .Os nódulos pulmonares defínense como opacidades focais de ata 3 cm de diámetro 5 .Afrontamos dificultades para avaliar a probabilidade de malignidade e xestionar o gran número de nódulos pulmonares detectados incidentalmente na LDCT.As limitacións da TC poden levar a exames de seguimento frecuentes e resultados falsos positivos, o que leva a intervencións innecesarias e tratamento excesivo6.Polo tanto, é necesario desenvolver biomarcadores fiables e útiles para identificar correctamente o cancro de pulmón nas fases iniciais e diferenciar a maioría dos nódulos benignos na detección inicial 7 .
A análise molecular exhaustiva do sangue (soero, plasma, células mononucleares de sangue periférico), incluíndo a xenómica, a proteómica ou a metilación do ADN8,9,10, levou a un interese crecente no descubrimento de biomarcadores de diagnóstico para o cancro de pulmón.Mentres tanto, os enfoques da metabolómica miden os produtos finais celulares que están influenciados por accións endóxenas e esóxenas e, polo tanto, aplícanse para predicir o inicio e o resultado da enfermidade.A cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS) é un método moi utilizado para estudos de metabolómica debido á súa alta sensibilidade e gran rango dinámico, que pode cubrir metabolitos con diferentes propiedades fisicoquímicas11,12,13.Aínda que a análise metabolómica global do plasma/soero utilizouse para identificar biomarcadores asociados ao diagnóstico de cancro de pulmón14,15,16,17 e á eficacia do tratamento,18 os clasificadores de metabolitos séricos para distinguir entre nódulos pulmonares benignos e malignos aínda están por estudar moito.- investigación masiva.
O adenocarcinoma e o carcinoma de células escamosas son os dous subtipos principais de cancro de pulmón de células non pequenas (NSCLC).Varias probas de detección de TC indican que o adenocarcinoma é o tipo histolóxico máis común de cancro de pulmón1,19,20,21.Neste estudo, utilizamos cromatografía líquida de ultra-performance-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS) para realizar análises metabolómicas nun total de 695 mostras de soro, incluíndo controis sans, nódulos pulmonares benignos e TC ≤3 cm detectados.Cribado de adenocarcinoma de pulmón en estadio I.Identificamos un panel de metabolitos séricos que distinguen o adenocarcinoma pulmonar dos nódulos benignos e os controis sans.A análise do enriquecemento da vía revelou que o metabolismo anormal do triptófano e da glicosa son alteracións comúns no adenocarcinoma pulmonar en comparación cos nódulos benignos e os controis sans.Finalmente, establecemos e validamos un clasificador metabólico sérico con alta especificidade e sensibilidade para distinguir entre nódulos pulmonares malignos e benignos detectados por LDCT, o que pode axudar no diagnóstico diferencial precoz e na avaliación do risco.
No estudo actual, recolléronse retrospectivamente mostras de soro compatibles por sexo e idade de 174 controis sans, 292 pacientes con nódulos pulmonares benignos e 229 pacientes con adenocarcinoma pulmonar en estadio I.As características demográficas dos 695 suxeitos móstranse na táboa complementaria 1.
Como se mostra na Figura 1a, un total de 480 mostras de soro, incluíndo 174 control saudable (HC), 170 nódulos benignos (BN) e 136 mostras de adenocarcinoma de pulmón (LA) en estadio I, foron recollidas no Sun Yat-sen University Cancer Center.Cohorte de descubrimento para o perfil metabolómico non dirixido mediante cromatografía líquida de ultra-rendemento e espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS).Como se mostra na figura complementaria 1, identificáronse metabolitos diferenciais entre LA e HC, LA e BN para establecer un modelo de clasificación e explorar máis a análise das vías diferenciais.104 mostras recollidas polo Sun Yat-sen University Cancer Center e 111 mostras recollidas por outros dous hospitais foron sometidas a validación interna e externa, respectivamente.
a Poboación do estudo na cohorte de descubrimentos que se someteu a análise metabolómica sérica global mediante cromatografía líquida de ultra-rendemento e espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS).b Análise discriminante de mínimos cadrados parcial (PLS-DA) do metaboloma total de 480 mostras de soro da cohorte do estudo, incluíndo controis sans (HC, n = 174), nódulos benignos (BN, n = 170) e adenocarcinoma de pulmón en estadio I. (Os Ánxeles, n = 136).+ESI, modo de ionización de electrospray positivo, -ESI, modo de ionización de electrospray negativo.c–e Os metabolitos con abundancias significativamente diferentes en dous grupos dados (proba de clasificación de Wilcoxon de dúas colas, valor p axustado da taxa de descubrimento falso, FDR <0,05) móstranse en vermello (cambio de veces > 1,2) e azul (cambio de veces < 0,83) .) que se mostra no gráfico do volcán.f Mapa térmico de agrupación xerárquica que mostra diferenzas significativas no número de metabolitos anotados entre LA e BN.Os datos de orixe ofrécense en forma de ficheiros de datos de orixe.
Analizouse o metaboloma sérico total de 174 HC, 170 BN e 136 LA no grupo de descubrimento mediante a análise UPLC-HRMS.Primeiro mostramos que as mostras de control de calidade (QC) se agrupan firmemente no centro dun modelo de análise de compoñentes principais (PCA) non supervisado, confirmando a estabilidade do rendemento do estudo actual (Figura complementaria 2).
Como se mostra na análise parcial de mínimos cadrados discriminantes (PLS-DA) da Figura 1b, descubrimos que había claras diferenzas entre LA e BN, LA e HC nos modos de ionización por electropulverización positiva (+ESI) e negativa (-ESI). .illado.Non obstante, non se atoparon diferenzas significativas entre BN e HC en condicións +ESI e -ESI.
Atopamos 382 características diferenciais entre LA e HC, 231 características diferenciais entre LA e BN e 95 características diferenciais entre BN e HC (test de rango asinado de Wilcoxon, FDR <0,05 e cambio múltiple >1,2 ou <0,83) (Figura .1c-e). )..Os picos foron anotados (datos suplementarios 3) nunha base de datos (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) polo valor m/z, o tempo de retención e a busca de espectro de masas de fragmentación (detalles descritos na sección Métodos) 22 .Finalmente, identificáronse 33 e 38 metabolitos anotados con diferenzas significativas na abundancia para LA versus BN (figura 1f e táboa complementaria 2) e LA versus HC (figura complementaria 3 e táboa complementaria 2), respectivamente.En cambio, só se identificaron 3 metabolitos con diferenzas significativas na abundancia en BN e HC (Táboa complementaria 2), consistente coa superposición entre BN e HC en PLS-DA.Estes metabolitos diferenciais cobren unha ampla gama de produtos bioquímicos (Figura complementaria 4).En conxunto, estes resultados demostran cambios significativos no metaboloma sérico que reflicten a transformación maligna do cancro de pulmón en fase inicial en comparación con nódulos pulmonares benignos ou suxeitos sans.Mentres tanto, a semellanza do metaboloma sérico de BN e HC suxire que os nódulos pulmonares benignos poden compartir moitas características biolóxicas con individuos sans.Dado que as mutacións xenéticas do receptor do factor de crecemento epidérmico (EGFR) son comúns no subtipo 23 do adenocarcinoma de pulmón, buscouse determinar o impacto das mutacións do condutor no metaboloma sérico.Despois analizamos o perfil metabolómico global de 72 casos con estado de EGFR no grupo de adenocarcinoma pulmonar.Curiosamente, atopamos perfís comparables entre pacientes mutantes de EGFR (n = 41) e pacientes de tipo salvaxe EGFR (n = 31) na análise de PCA (Figura complementaria 5a).Non obstante, identificamos 7 metabolitos cuxa abundancia se viu alterada significativamente en pacientes con mutación de EGFR en comparación con pacientes con EGFR de tipo salvaxe (proba t, p <0,05 e cambio de dobra> 1,2 ou <0,83) (Figura complementaria 5b).A maioría destes metabolitos (5 de cada 7) son acilcarnitinas, que xogan un papel importante nas vías de oxidación dos ácidos graxos.
Como se ilustra no fluxo de traballo que se mostra na Figura 2a, os biomarcadores para a clasificación de nódulos obtivéronse utilizando operadores de encollemento mínimo e selección en función de 33 metabolitos diferenciais identificados en LA (n = 136) e BN (n = 170).Mellor combinación de variables (LASSO): modelo de regresión loxística binaria.Utilizouse unha validación cruzada dez veces para probar a fiabilidade do modelo.A selección de variables e a regularización de parámetros axústanse mediante unha penalización de maximización de probabilidade co parámetro λ24.A análise da metabolómica global realizouse ademais de forma independente nos grupos de validación interna (n = 104) e validación externa (n = 111) para probar o rendemento da clasificación do modelo discriminante.Como resultado, 27 metabolitos do conxunto de descubrimento foron identificados como o mellor modelo discriminante co maior valor medio de AUC (Fig. 2b), entre os que 9 aumentaron a actividade e 18 diminuíron a actividade en LA en comparación co BN (Fig. 2c).
Fluxo de traballo para construír un clasificador de nódulos pulmonares, incluíndo a selección do mellor panel de metabolitos séricos no conxunto de descubrimento mediante un modelo de regresión loxística binaria mediante validación cruzada dez veces e avaliando o rendemento preditivo en conxuntos de validación interna e externa.b Estadísticas de validación cruzada do modelo de regresión LASSO para a selección de biomarcadores metabólicos.Os números indicados arriba representan o número medio de biomarcadores seleccionados nun λ dado.A liña punteada vermella representa o valor medio de AUC no lambda correspondente.As barras de erro grises representan os valores AUC mínimo e máximo.A liña de puntos indica o mellor modelo cos 27 biomarcadores seleccionados.AUC, área baixo a curva característica de operación do receptor (ROC).c Cambios de dobra de 27 metabolitos seleccionados no grupo LA en comparación co grupo BN no grupo de descubrimento.Columna vermella - activación.A columna azul é un descenso.d–f Curvas de características operativas do receptor (ROC) que mostran a potencia do modelo discriminante baseado en 27 combinacións de metabolitos nos conxuntos de validación de descubrimento, interno e externo.Os datos de orixe ofrécense en forma de ficheiros de datos de orixe.
Creouse un modelo de predición baseado nos coeficientes de regresión ponderados destes metabolitos 27 (táboa complementaria 3).A análise ROC baseada nestes 27 metabolitos deu un valor de área baixo a curva (AUC) de 0,933, a sensibilidade do grupo de descubrimento foi de 0,868 e a especificidade de 0,859 (Fig. 2d).Mentres tanto, entre os 38 metabolitos diferenciais anotados entre LA e HC, un conxunto de 16 metabolitos alcanzou un AUC de 0,902 cunha sensibilidade de 0,801 e especificidade de 0,856 ao discriminar LA de HC (Figura complementaria 6a-c).Tamén se compararon os valores de AUC baseados en diferentes limiares de cambio de prega para metabolitos diferenciais.Descubrimos que o modelo de clasificación funcionou mellor para discriminar entre LA e BN (HC) cando o nivel de cambio de dobra se estableceu en 1.2 fronte a 1.5 ou 2.0 (Figura complementaria 7a, b).O modelo de clasificación, baseado en 27 grupos de metabolitos, foi máis validado en cohortes internas e externas.O AUC foi de 0,915 (sensibilidade 0,867, especificidade 0,811) para validación interna e 0,945 (sensibilidade 0,810, especificidade 0,979) para validación externa (Fig. 2e, f).Para avaliar a eficiencia interlaboratorio, analizáronse 40 mostras da cohorte externa nun laboratorio externo tal e como se describe na sección de Métodos.A precisión da clasificación alcanzou un AUC de 0,925 (Figura complementaria 8).Dado que o carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) é o segundo subtipo máis común de cancro de pulmón de células non pequenas (NSCLC) despois do adenocarcinoma de pulmón (LUAD), tamén probamos a utilidade potencial validada dos perfís metabólicos.BN e 16 casos de LUSC.O AUC de discriminación entre LUSC e BN foi de 0,776 (figura complementaria 9), o que indica unha menor capacidade en comparación coa discriminación entre LUAD e BN.
Os estudos demostraron que o tamaño dos nódulos nas imaxes de TC está correlacionado positivamente coa probabilidade de malignidade e segue sendo un importante determinante do tratamento dos nódulos25,26,27.A análise dos datos da gran cohorte do estudo de cribado NELSON mostrou que o risco de malignidade en suxeitos con ganglios < 5 mm era mesmo similar ao dos suxeitos sen ganglios 28 .Polo tanto, o tamaño mínimo que require un seguimento por TC regular é de 5 mm, segundo recomenda a British Thoracic Society (BTS), e de 6 mm, segundo recomenda a Fleischner Society 29 .Non obstante, os nódulos maiores de 6 mm e sen características benignas obvias, chamados nódulos pulmonares indeterminados (NPI), seguen sendo un gran desafío na avaliación e xestión na práctica clínica30,31.A continuación examinamos se o tamaño dos nódulos influíu nas firmas metabolómicas utilizando mostras agrupadas das cohortes de descubrimento e validación interna.Centrándonos en 27 biomarcadores validados, primeiro comparamos os perfís PCA dos metabolomas HC e BN sub-6 mm.Descubrimos que a maioría dos puntos de datos para HC e BN se solapaban, demostrando que os niveis de metabolitos séricos eran similares en ambos os grupos (Fig. 3a).Os mapas de características en diferentes rangos de tamaño mantivéronse conservados en BN e LA (Fig. 3b, c), mentres que se observou unha separación entre nódulos malignos e benignos no rango de 6-20 mm (Fig. 3d).Esta cohorte tiña un AUC de 0,927, especificidade de 0,868 e sensibilidade de 0,820 para predicir a malignidade de nódulos de 6 a 20 mm (Fig. 3e, f).Os nosos resultados mostran que o clasificador pode capturar os cambios metabólicos causados pola transformación maligna precoz, independentemente do tamaño dos nódulos.
ad Comparación de perfís de PCA entre grupos especificados baseada nun clasificador metabólico de 27 metabolitos.CC e BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.en LA 6–20 mm fronte a LA 20–30 mm.g BN 6-20 mm e LA 6-20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6-20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Curva da característica operativa do receptor (ROC) que mostra o rendemento do modelo discriminante para nódulos de 6–20 mm.f Os valores de probabilidade calculáronse a partir do modelo de regresión loxística para nódulos de 6-20 mm.A liña de puntos grises representa o valor de corte óptimo (0,455).Os números anteriores representan a porcentaxe de casos proxectados para Los Ángeles.Use unha proba t de Student de dúas colas.PCA, análise de compoñentes principais.Área AUC baixo a curva.Os datos de orixe ofrécense en forma de ficheiros de datos de orixe.
Seleccionáronse aínda máis catro mostras (entre 44 e 61 anos) con tamaños de nódulos pulmonares similares (7-9 mm) para ilustrar o rendemento do modelo de predición de malignidade proposto (Fig. 4a, b).No exame inicial, o caso 1 presentouse como un nódulo sólido con calcificación, unha característica asociada á benignidade, mentres que o caso 2 presentouse como un nódulo parcialmente sólido indeterminado sen características benignas obvias.Tres quendas de TC de seguimento mostraron que estes casos permaneceron estables durante un período de 4 anos e, polo tanto, foron considerados nódulos benignos (Fig. 4a).En comparación coa avaliación clínica de tomografías computarizadas en serie, a análise de metabolitos séricos dun só tiro co modelo clasificador actual identificou de forma rápida e correcta estes nódulos benignos en función de restricións probabilísticas (táboa 1).A figura 4b no caso 3 mostra un nódulo con signos de retracción pleural, que se asocia con maior frecuencia a malignidade32.O caso 4 presentouse como un nódulo parcialmente sólido indeterminado sen evidencia de causa benigna.Todos estes casos foron previstos como malignos segundo o modelo clasificador (táboa 1).A avaliación do adenocarcinoma pulmonar demostrouse mediante o exame histopatolóxico despois da cirurxía de resección pulmonar (Fig. 4b).Para o conxunto de validación externa, o clasificador metabólico predixo con precisión dous casos de nódulos pulmonares indeterminados maiores de 6 mm (Figura complementaria 10).
Imaxes de TC da ventá axial dos pulmóns de dous casos de nódulos benignos.No caso 1, a tomografía computarizada despois de 4 anos mostrou un nódulo sólido estable de 7 mm con calcificación no lóbulo inferior dereito.No caso 2, a tomografía computarizada despois de 5 anos revelou un nódulo estable e parcialmente sólido cun diámetro de 7 mm no lóbulo superior dereito.b Imaxes de TC de xanela axial dos pulmóns e estudos patolóxicos correspondentes de dous casos de adenocarcinoma en estadio I antes da resección pulmonar.O caso 3 revelou un nódulo cun diámetro de 8 mm no lóbulo superior dereito con retracción pleural.O caso 4 revelou un nódulo de vidro esmerilado parcialmente sólido que mide 9 mm no lóbulo superior esquerdo.Tinción con hematoxilina e eosina (H&E) do tecido pulmonar resecado (barra de escala = 50 μm) que demostra o patrón de crecemento acinar do adenocarcinoma pulmonar.As frechas indican nódulos detectados nas imaxes de TC.As imaxes H&E son imaxes representativas de múltiples (>3) campos microscópicos examinados polo patólogo.
En conxunto, os nosos resultados demostran o valor potencial dos biomarcadores de metabolitos séricos no diagnóstico diferencial dos nódulos pulmonares, o que pode supoñer desafíos ao avaliar o cribado por TC.
Baseándonos nun panel de metabolitos diferenciais validado, buscamos identificar os correlatos biolóxicos dos principais cambios metabólicos.A análise de enriquecemento da vía KEGG realizada por MetaboAnalyst identificou 6 vías comúns significativamente alteradas entre os dous grupos dados (LA vs. HC e LA vs. BN, p axustado ≤ 0,001, efecto > 0,01).Estes cambios caracterizáronse por alteracións no metabolismo do piruvato, do triptófano, da niacina e da nicotinamida, da glicólise, do ciclo do TCA e do metabolismo das purinas (Fig. 5a).Despois realizamos metabolómicas dirixidas para verificar cambios importantes mediante a cuantificación absoluta.Determinación de metabolitos comúns en vías alteradas comúnmente mediante espectrometría de masas de triplo cuadrupolo (QQQ) utilizando estándares de metabolitos auténticos.As características demográficas da mostra obxectivo do estudo de metabolómica inclúense na táboa complementaria 4. En consonancia cos resultados globais de metabolómica, a análise cuantitativa confirmou que a hipoxantina e a xantina, o piruvato e o lactato aumentaron en LA en comparación con BN e HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Non obstante, non se atoparon diferenzas significativas nestes metabolitos entre BN e HC.
Análise de enriquecemento da vía KEGG de metabolitos significativamente diferentes no grupo LA en comparación cos grupos BN e HC.Utilizouse un Globaltest de dúas colas e os valores de p axustáronse mediante o método Holm-Bonferroni (p axustado ≤ 0,001 e tamaño do efecto > 0,01).b–d Gráficos de violín que amosan os niveis de hipoxantina, xantina, lactato, piruvato e triptófano en HC, BN e LA séricos determinados por LC-MS/MS (n = 70 por grupo).As liñas de puntos brancas e negras indican a mediana e o cuartil, respectivamente.e Gráfico de violín que mostra a expresión normalizada de ARNm de Log2TPM (transcricións por millón) de SLC7A5 e QPRT no adenocarcinoma pulmonar (n = 513) en comparación co tecido pulmonar normal (n = 59) no conxunto de datos LUAD-TCGA.A caixa branca representa o intervalo intercuartílico, a liña negra horizontal no centro representa a mediana e a liña negra vertical que se estende dende a caixa representa o intervalo de confianza (IC) do 95 %.f Gráfico de correlación de Pearson da expresión de SLC7A5 e GAPDH no adenocarcinoma pulmonar (n = 513) e no tecido pulmonar normal (n = 59) no conxunto de datos TCGA.A área gris representa o IC do 95%.r, coeficiente de correlación de Pearson.g Niveis de triptófano celular normalizados en células A549 transfectadas con control de shRNA (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) inespecíficos determinados por LC-MS/MS.Preséntase a análise estatística de cinco mostras bioloxicamente independentes en cada grupo.h Niveis celulares de NADt (NAD total, incluíndo NAD+ e NADH) nas células A549 (NC) e as células A549 derribadas SLC7A5 (Sh1, Sh2).Preséntase a análise estatística de tres mostras bioloxicamente independentes en cada grupo.i A actividade glicolítica das células A549 antes e despois da caída de SLC7A5 mediuse mediante a taxa de acidificación extracelular (ECAR) (n = 4 mostras bioloxicamente independentes por grupo).2-DG,2-desoxi-D-glicosa.Utilizouse a proba t de Student de dúas colas en (b–h).En (g–i), as barras de erro representan a media ± SD, cada experimento realizouse tres veces de forma independente e os resultados foron similares.Os datos de orixe ofrécense en forma de ficheiros de datos de orixe.
Tendo en conta o impacto significativo do metabolismo alterado do triptófano no grupo LA, tamén avaliamos os niveis de triptófano sérico nos grupos HC, BN e LA usando QQQ.Descubrimos que o triptófano sérico reduciuse en LA en comparación con HC ou BN (p < 0,001, Figura 5d), o que é consistente con descubrimentos anteriores de que os niveis de triptófano circulante son máis baixos en pacientes con cancro de pulmón que en controis sans do grupo control33,34. ,35.Outro estudo que utilizou o trazador PET/CT 11C-metil-L-triptófano descubriu que o tempo de retención do sinal de triptófano no tecido do cancro de pulmón aumentou significativamente en comparación coas lesións benignas ou o tecido normal36.A hipótese de que a diminución do triptófano no soro LA pode reflectir a captación activa de triptófano polas células do cancro de pulmón.
Tamén se sabe que o produto final da vía da quinurenina do catabolismo do triptófano é NAD+37,38, que é un substrato importante para a reacción do gliceraldehído-3-fosfato co 1,3-bisfosfoglicerato na glicólise39.Aínda que estudos anteriores centráronse no papel do catabolismo do triptófano na regulación inmune, buscamos dilucidar a interacción entre a desregulación do triptófano e as vías glicolíticas observadas no estudo actual.Sábese que o membro 5 da familia 7 do transportador de solutos (SLC7A5) é un transportador de triptófano43,44,45.A fosforibosiltransferase do ácido quinolínico (QPRT) é un encima situado augas abaixo da vía da quinurenina que converte o ácido quinolínico en NAMN46.A inspección do conxunto de datos LUAD TCGA revelou que tanto SLC7A5 como QPRT estaban significativamente regulados no tecido tumoral en comparación co tecido normal (Fig. 5e).Este aumento observouse nos estadios I e II, así como nos estadios III e IV do adenocarcinoma pulmonar (figura complementaria 11), o que indica alteracións precoces no metabolismo do triptófano asociados á tumorigénesis.
Ademais, o conxunto de datos LUAD-TCGA mostrou unha correlación positiva entre a expresión de ARNm de SLC7A5 e GAPDH en mostras de pacientes con cancro (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f).En cambio, non se atopou ningunha correlación significativa entre tales sinaturas de xenes no tecido pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f).A caída de SLC7A5 (Figura complementaria 12) nas células A549 reduciu significativamente os niveis de triptófano celular e NAD(H) (Figura 5g, h), obtendo unha actividade glicolítica atenuada medida pola taxa de acidificación extracelular (ECAR) (Figura 1).5i).Así, baseándonos nos cambios metabólicos no soro e na detección in vitro, a hipótese de que o metabolismo do triptófano pode producir NAD+ a través da vía da quinurenina e desempeñar un papel importante na promoción da glicólise no cancro de pulmón.
Os estudos demostraron que un gran número de nódulos pulmonares indeterminados detectados por LDCT poden levar á necesidade de probas adicionais como PET-TC, biopsia pulmonar e tratamento excesivo debido a un diagnóstico falso positivo de malignidade.31 Como se mostra na Figura 6, o noso estudo identificou un panel de metabolitos séricos con potencial valor diagnóstico que poden mellorar a estratificación do risco e o tratamento posterior dos nódulos pulmonares detectados por TC.
Os nódulos pulmonares avalíanse mediante tomografía computarizada de baixa dose (LDCT) con características de imaxe que suxiren causas benignas ou malignas.O resultado incerto dos nódulos pode levar a visitas de seguimento frecuentes, intervencións innecesarias e tratamento excesivo.A inclusión de clasificadores metabólicos séricos con valor diagnóstico pode mellorar a avaliación do risco e o posterior manexo dos nódulos pulmonares.Tomografía por emisión de positrones PET.
Os datos do estudo NLST dos Estados Unidos e do estudo europeo NELSON suxiren que o cribado de grupos de alto risco con tomografía computarizada de baixa dose (LDCT) pode reducir a mortalidade por cancro de pulmón1,3.Non obstante, a avaliación do risco e a posterior xestión clínica de gran número de nódulos pulmonares incidentais detectados por LDCT seguen sendo os máis desafiantes.O obxectivo principal é optimizar a correcta clasificación dos protocolos existentes baseados en LDCT incorporando biomarcadores fiables.
Identificáronse certos biomarcadores moleculares, como os metabolitos sanguíneos, comparando o cancro de pulmón con controis sans15,17.No estudo actual, centrámonos na aplicación da análise da metabolómica sérica para distinguir entre nódulos pulmonares benignos e malignos detectados incidentalmente por LDCT.Comparamos o metaboloma sérico global de control saudable (HC), nódulos pulmonares benignos (BN) e mostras de adenocarcinoma pulmonar (LA) en estadio I mediante a análise UPLC-HRMS.Descubrimos que HC e BN tiñan perfís metabólicos similares, mentres que LA mostrou cambios significativos en comparación con HC e BN.Identificamos dous conxuntos de metabolitos séricos que diferencian LA de HC e BN.
O esquema actual de identificación baseado na LDCT para nódulos benignos e malignos baséase principalmente no tamaño, densidade, morfoloxía e taxa de crecemento dos nódulos ao longo do tempo30.Estudos anteriores demostraron que o tamaño dos nódulos está intimamente relacionado coa probabilidade de cancro de pulmón.Incluso en pacientes de alto risco, o risco de malignidade nos ganglios <6 mm é <1%.O risco de malignidade para nódulos de 6 a 20 mm oscila entre o 8% e o 64%30.Polo tanto, a Sociedade Fleischner recomenda un diámetro de corte de 6 mm para o seguimento rutinario da TC.29 Non obstante, a avaliación do risco e o manexo dos nódulos pulmonares indeterminados (NPI) maiores de 6 mm non se realizaron adecuadamente 31 .O tratamento actual da enfermidade cardíaca conxénita adoita estar baseado na espera atenta con monitorización por TC frecuente.
Baseándonos no metaboloma validado, demostramos por primeira vez a superposición de sinaturas metabolómicas entre individuos sans e nódulos benignos <6 mm.A semellanza biolóxica é consistente cos descubrimentos previos de TC de que o risco de malignidade para nódulos <6 mm é tan baixo como para suxeitos sen ganglios. semellanza nos perfís metabolómicos, o que suxire que a definición funcional da etioloxía benigna é consistente independentemente do tamaño dos nódulos.Así, os modernos paneis de metabolitos séricos de diagnóstico poden proporcionar un único ensaio como proba de descarte cando se detectan inicialmente nódulos na TC e poden reducir o seguimento en serie.Ao mesmo tempo, o mesmo panel de biomarcadores metabólicos distinguiu nódulos malignos ≥6 mm de tamaño dos nódulos benignos e proporcionou predicións precisas para IPN de tamaño similar e características morfolóxicas ambiguas nas imaxes de TC.Este clasificador do metabolismo sérico funcionou ben ao predicir a malignidade de nódulos ≥6 mm cun AUC de 0,927.En conxunto, os nosos resultados indican que as sinaturas metabolómicas séricas únicas poden reflectir especificamente cambios metabólicos iniciais inducidos polo tumor e ter un valor potencial como predictores de risco, independentemente do tamaño dos nódulos.
Notablemente, o adenocarcinoma de pulmón (LUAD) e o carcinoma de células escamosas (LUSC) son os principais tipos de cancro de pulmón de células non pequenas (NSCLC).Dado que o LUSC está fortemente asociado co consumo de tabaco47 e que o LUAD é a histoloxía máis común dos nódulos pulmonares incidentais detectados no cribado por TC48, o noso modelo clasificador foi construído especificamente para mostras de adenocarcinoma en estadio I.Wang e os seus colegas tamén se centraron no LUAD e identificaron nove sinaturas lipídicas usando lipidómica para distinguir o cancro de pulmón en fase inicial dos individuos sans17.Probamos o modelo de clasificador actual en 16 casos de LUSC en etapa I e 74 nódulos benignos e observamos unha baixa precisión de predición de LUSC (AUC 0,776), o que suxire que LUAD e LUSC poden ter as súas propias sinaturas metabolómicas.De feito, demostrouse que LUAD e LUSC difiren en etioloxía, orixe biolóxica e aberracións xenéticas49.Polo tanto, outros tipos de histoloxía deberían incluírse nos modelos de adestramento para a detección baseada na poboación do cancro de pulmón nos programas de cribado.
Aquí, identificamos as seis vías alteradas máis frecuentemente no adenocarcinoma pulmonar en comparación con controis sans e nódulos benignos.A xantina e a hipoxantina son metabolitos comúns da vía metabólica das purinas.En consonancia cos nosos resultados, os intermediarios asociados co metabolismo das purinas aumentaron significativamente no soro ou nos tecidos dos pacientes con adenocarcinoma pulmonar en comparación con controis sans ou pacientes en fase preinvasiva15,50.Os niveis séricos elevados de xantina e hipoxantina poden reflectir o anabolismo que requiren as células cancerosas que proliferan rapidamente.A desregulación do metabolismo da glicosa é un selo ben coñecido do metabolismo do cancro51.Aquí, observamos un aumento significativo de piruvato e lactato no grupo LA en comparación co grupo HC e BN, o que é consistente con informes anteriores de anomalías da vía glicolítica nos perfís do metaboloma sérico de pacientes con cancro de pulmón de células non pequenas (NSCLC) e controis saudables.os resultados son consistentes52,53.
É importante destacar que observamos unha correlación inversa entre o metabolismo do piruvato e do triptófano no soro dos adenocarcinomas pulmonares.Os niveis séricos de triptófano reducíronse no grupo LA en comparación co grupo HC ou BN.Curiosamente, un estudo previo a gran escala que utilizou unha cohorte prospectiva descubriu que os niveis baixos de triptófano circulante estaban asociados a un maior risco de cancro de pulmón 54 .O triptófano é un aminoácido esencial que obtemos integramente dos alimentos.Concluímos que o esgotamento do triptófano sérico no adenocarcinoma pulmonar pode reflectir o esgotamento rápido deste metabolito.É ben sabido que o produto final do catabolismo do triptófano a través da vía da quinurenina é a fonte da síntese de novo de NAD+.Dado que o NAD+ prodúcese principalmente pola vía de salvamento, a importancia do NAD+ no metabolismo do triptófano na saúde e na enfermidade aínda está por determinar46.A nosa análise da base de datos TCGA mostrou que a expresión do transportador de solutos do transportador de triptófano 7A5 (SLC7A5) aumentou significativamente no adenocarcinoma de pulmón en comparación cos controis normais e que se correlacionou positivamente coa expresión da encima glicolítica GAPDH.Estudos anteriores centráronse principalmente no papel do catabolismo do triptófano na supresión da resposta inmune antitumoral40,41,42.Aquí demostramos que a inhibición da captación de triptófano polo derrumbe de SLC7A5 nas células do cancro de pulmón ten como resultado unha diminución posterior dos niveis de NAD celular e unha atenuación concomitante da actividade glicolítica.En resumo, o noso estudo proporciona unha base biolóxica para os cambios no metabolismo do soro asociados á transformación maligna do adenocarcinoma pulmonar.
As mutacións do EGFR son as mutacións controladoras máis comúns en pacientes con NSCLC.No noso estudo, descubrimos que os pacientes con mutación de EGFR (n = 41) tiñan perfís metabolómicos xerais similares aos pacientes con EGFR de tipo salvaxe (n = 31), aínda que atopamos niveis séricos diminuídos dalgúns pacientes mutantes de EGFR en pacientes con acilcarnitina.A función establecida das acilcarnitinas é transportar grupos acilo do citoplasma á matriz mitocondrial, o que leva á oxidación dos ácidos graxos para producir enerxía 55 .En consonancia cos nosos descubrimentos, un estudo recente tamén identificou perfís de metaboloma similares entre os tumores mutantes de EGFR e os de tipo salvaxe de EGFR ao analizar o metaboloma global de 102 mostras de tecido de adenocarcinoma de pulmón50.Curiosamente, o contido de acilcarnitina tamén se atopou no grupo mutante EGFR.Polo tanto, se os cambios nos niveis de acilcarnitina reflicten cambios metabólicos inducidos polo EGFR e as vías moleculares subxacentes poden merecer un estudo máis profundo.
En conclusión, o noso estudo establece un clasificador metabólico sérico para o diagnóstico diferencial dos nódulos pulmonares e propón un fluxo de traballo que poida optimizar a avaliación do risco e facilitar a xestión clínica baseada no cribado por TAC.
Este estudo foi aprobado polo Comité de Ética do Hospital Cancro Universitario de Sun Yat-sen, o Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Sun Yat-sen e o Comité de Ética do Hospital Cancro Universitario de Zhengzhou.Nos grupos de descubrimento e validación interna, recolléronse 174 soros de individuos sans e 244 de nódulos benignos de individuos sometidos a exames médicos anuais no Departamento de Control e Prevención do Cancro, Sun Yat-sen University Cancer Center e 166 nódulos benignos.soro.Os adenocarcinomas de pulmón en estadio I recolléronse do Sun Yat-sen University Cancer Center.Na cohorte de validación externa, houbo 48 casos de nódulos benignos, 39 casos de adenocarcinoma pulmonar en estadio I do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen e 24 casos de adenocarcinoma pulmonar en estadio I do Hospital de Cancro de Zhengzhou.O Sun Yat-sen University Cancer Center tamén recolleu 16 casos de cancro de pulmón de células escamosas en estadio I para probar a capacidade de diagnóstico do clasificador metabólico establecido (as características do paciente móstranse na táboa complementaria 5).Recolléronse mostras da cohorte de descubrimento e da cohorte de validación interna entre xaneiro de 2018 e maio de 2020. As mostras para a cohorte de validación externa recolléronse entre agosto de 2021 e outubro de 2022. Para minimizar o sesgo de xénero, asignáronse a cada un un número aproximadamente igual de casos masculinos e femininos. cohorte.Equipo de descubrimento e equipo de revisión interna.O sexo dos participantes determinouse en base ao autoinforme.Obtívose o consentimento informado de todos os participantes e non se proporcionou ningunha compensación.Os suxeitos con nódulos benignos foron aqueles cunha puntuación de TC estable entre 2 e 5 anos no momento da análise, agás 1 caso da mostra de validación externa, que foi recollida preoperatoriamente e diagnosticada por histopatoloxía.Coa excepción da bronquite crónica.Os casos de adenocarcinoma pulmonar recolléronse antes da resección pulmonar e confirmáronse mediante diagnóstico patolóxico.Recolléronse mostras de sangue en xaxún en tubos de separación de soro sen anticoagulantes.As mostras de sangue coaguláronse durante 1 hora a temperatura ambiente e despois centrifugáronse a 2851 × g durante 10 minutos a 4 °C para recoller o sobrenadante do soro.As alícuotas de soro conxeláronse a -80 °C ata a extracción do metabolito.O Departamento de Prevención do Cancro e Exame Médico do Centro de Cancro da Universidade de Sun Yat-sen recolleu un grupo de soro de 100 doadores sans, incluíndo un número igual de homes e mulleres de 40 a 55 anos.Mesturáronse volumes iguais de cada mostra doante, o conxunto resultante foi dividido en alícuotas e almacenouse a -80 °C.A mestura de soro utilizouse como material de referencia para o control de calidade e a estandarización dos datos.
Desconxeláronse o soro de referencia e as mostras de proba e extraéronse os metabolitos mediante un método de extracción combinado (MTBE/metanol/auga) 56 .Brevemente, mesturáronse 50 μl de soro con 225 μl de metanol xeado e 750 μl de metil terc-butil éter (MTBE).Mestura a mestura e incuba no xeo durante 1 hora.A continuación mesturáronse as mostras e mesturáronse en vórtice con 188 μl de auga de grao MS que contén patróns internos (lactato 13C, piruvato 13C3, metionina 13C e isoleucina 13C6, adquiridos a Cambridge Isotope Laboratories).Despois centrifugouse a mestura a 15.000 × g durante 10 min a 4 °C, e a fase inferior foi transferida a dous tubos (125 μl cada un) para a análise LC-MS en modo positivo e negativo.Finalmente, a mostra evaporouse ata seca nun concentrador de baleiro de alta velocidade.
Os metabolitos secos reconstituíronse en 120 μl de acetonitrilo ao 80%, vórtexáronse durante 5 min e centrifugáronse a 15.000 × g durante 10 min a 4 °C.Os sobrenadantes foron transferidos a frascos de vidro ámbar con microinsertos para estudos de metabolómica.Análise metabolómica non dirixida nunha plataforma de cromatografía líquida de ultra-rendemento e espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS).Os metabolitos separáronse mediante un sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC e unha columna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).No modo de ións positivos, as fases móbiles foron 95% (A) e 50% acetonitrilo (B), cada unha contén 10 mmol/L de acetato de amonio e 0,1% de ácido fórmico.En modo negativo, as fases móbiles A e B contiñan 95% e 50% de acetonitrilo, respectivamente, ambas as dúas fases contiñan 10 mmol/L de acetato de amonio, pH = 9. O programa de gradientes foi o seguinte: 0-0,5 min, 2% B;0,5-12 min, 2-50% B;12-14 min, 50-98 % B;14-16 min, 98 % B;16–16.1.mín, 98 –2% B;16,1-20 min, 2% B. A columna mantívose a 40 °C e a mostra a 10 °C no mostrador automático.O caudal foi de 0,3 ml/min, o volume de inxección de 3 μl.Utilizouse un espectrómetro de masas Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) cunha fonte de ionización por electropulverización (ESI) en modo de exploración completa e xunto co modo de monitorización ddMS2 para recoller grandes volumes de datos.Os parámetros MS establecéronse do seguinte xeito: tensión de pulverización +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura capilar 320 °C, gas de protección 40 arb, gas auxiliar 10 arb, temperatura do quentador da sonda 350 °C, rango de exploración 70-1050 m/h, resolución.70 000. Os datos foron adquiridos mediante Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Para avaliar a calidade dos datos, xeraron mostras agrupadas de control de calidade (QC) eliminando alícuotas de 10 μL do sobrenadante de cada mostra.Analizáronse seis inxeccións de mostras de control de calidade ao comezo da secuencia analítica para avaliar a estabilidade do sistema UPLC-MS.Despois introdúcense periodicamente mostras de control de calidade no lote.Os 11 lotes de mostras de soro deste estudo foron analizados por LC-MS.Utilizáronse alícuotas dunha mestura de soro de 100 doadores sans como material de referencia nos respectivos lotes para controlar o proceso de extracción e axustar os efectos de lote a lote.No Centro de Metabolómica da Universidade Sun Yat-sen realizouse unha análise metabolómica non dirixida da cohorte de descubrimento, a cohorte de validación interna e a cohorte de validación externa.O laboratorio externo do Centro de Ensaios e Análise da Universidade de Tecnoloxía de Guangdong tamén analizou 40 mostras da cohorte externa para probar o rendemento do modelo clasificador.
Despois da extracción e reconstitución, mediuse a cuantificación absoluta dos metabolitos séricos mediante cromatografía líquida de ultra-alto rendemento e espectrometría de masas en tándem (Agilent 6495 triple quadrupolo) cunha fonte de ionización por electrospray (ESI) en modo de monitorización de reaccións múltiples (MRM).Utilizouse unha columna de amida ACQUITY BEH (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) para separar os metabolitos.A fase móbil constaba dun 90% (A) e un 5% de acetonitrilo (B) con 10 mmol/L de acetato de amonio e unha solución de amoníaco ao 0,1%.O programa de gradientes foi o seguinte: 0-1,5 min, 0% B;1,5-6,5 min, 0-15% B;6,5-8 min, 15 % B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0 % B.A columna mantívose a 40 °C e a mostra a 10 °C no mostrador automático.O caudal foi de 0,3 ml/min e o volume de inxección de 1 μl.Os parámetros MS establecéronse do seguinte xeito: tensión capilar ± 3,5 kV, presión do nebulizador 35 psi, fluxo de gas de vaina 12 l/min, temperatura de gas de vaíña 350 °C, temperatura de gas de secado 250 °C e fluxo de gas de secado 14 l/min.As conversións MRM de triptófano, piruvato, lactato, hipoxantina e xantina foron 205,0-187,9, 87,0-43,4, 89,0-43,3, 135,0-92,3 e 151,0-107.9 respectivamente.Os datos recompiláronse mediante Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Para as mostras de soro, cuantificáronse triptófano, piruvato, lactato, hipoxantina e xantina mediante curvas de calibración de solucións de mestura estándar.Para as mostras de células, o contido de triptófano normalizouse ao estándar interno e á masa de proteína celular.
A extracción de picos (m/z e tempo de retención (RT)) realizouse usando Compound Discovery 3.1 e TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Para eliminar as diferenzas potenciais entre lotes, dividiuse cada pico característico da mostra de ensaio polo pico característico do material de referencia do mesmo lote para obter a abundancia relativa.As desviacións estándar relativas dos estándares internos antes e despois da estandarización móstranse na táboa complementaria 6. As diferenzas entre os dous grupos caracterizáronse pola taxa de descubrimento falso (FDR <0,05, proba de rango con signo de Wilcoxon) e cambio de dobra (> 1,2 ou <0,83).Os datos de MS en bruto das características extraídas e os datos de MS de referencia corrixidos polo soro móstranse nos datos complementarios 1 e datos complementarios 2, respectivamente.A anotación máxima realizouse en base a catro niveis definidos de identificación, incluíndo metabolitos identificados, compostos supostamente anotados, clases de compostos supostamente caracterizados e compostos descoñecidos 22 .En base a buscas de bases de datos en Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), finalmente seleccionáronse compostos biolóxicos con estándares validados coincidentes MS/MS ou anotacións de coincidencia exacta en mzCloud (puntuación > 85) ou Chemspider como intermediarios entre o metaboloma diferencial.As anotacións máximas para cada característica inclúense nos datos suplementarios 3. Utilizouse MetaboAnalyst 5.0 para a análise univariada da abundancia de metabolitos normalizados por suma.MetaboAnalyst 5.0 tamén avaliou a análise de enriquecemento da vía KEGG baseada en metabolitos significativamente diferentes.Analizáronse a análise de compoñentes principais (PCA) e a análise discriminante de mínimos cadrados parciais (PLS-DA) mediante o paquete de software ropls (v.1.26.4) con normalización de pila e autoescalado.O modelo óptimo de biomarcadores de metabolitos para predicir a malignidade dos nódulos xerou mediante regresión loxística binaria con operador de selección e encollemento mínimo absoluto (LASSO, paquete R v.4.1-3).O rendemento do modelo discriminante nos conxuntos de detección e validación caracterizouse pola estimación do AUC en función da análise ROC segundo o paquete pROC (v.1.18.0.).O corte de probabilidade óptimo obtívose en función do índice de Youden máximo do modelo (sensibilidade + especificidade - 1).As mostras con valores inferiores ou superiores ao limiar prediciranse como nódulos benignos e adenocarcinoma pulmonar, respectivamente.
As células A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) cultiváronse en medio F-12K que contiña 10% de FBS.No vector lentiviral pLKO.1-puro inseríronse secuencias curtas de ARN (shRNA) en forquilla dirixidas a SLC7A5 e un control non-targeting (NC).As secuencias antisentido de shSLC7A5 son as seguintes: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Os anticorpos contra SLC7A5 (#5347) e tubulina (#2148) foron adquiridos da Cell Signaling Technology.Utilizáronse anticorpos contra SLC7A5 e tubulina nunha dilución de 1:1000 para a análise Western blot.
A proba de estrés glicolítico Seahorse XF mide os niveis de acidificación extracelular (ECAR).No ensaio, administráronse secuencialmente glicosa, oligomicina A e 2-DG para probar a capacidade glicolítica celular medida por ECAR.
As células A549 transfectadas con control non dirixido (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) colocáronse durante a noite en pratos de 10 cm de diámetro.Os metabolitos celulares foron extraídos con 1 ml de metanol acuoso ao 80 % xeado.As células da solución de metanol foron raspadas, recollidas nun novo tubo e centrifugadas a 15.000 × g durante 15 min a 4 °C.Recoller 800 µl de sobrenadante e secar usando un concentrador de baleiro de alta velocidade.Os gránulos de metabolitos secos analizáronse entón para determinar os niveis de triptófano usando LC-MS/MS como se describe anteriormente.Os niveis de NAD(H) celular en células A549 (NC e shSLC7A5) foron medidos mediante un kit colorimétrico de NAD+/NADH cuantitativo (#K337, BioVision) segundo as instrucións do fabricante.Os niveis de proteínas midéronse para cada mostra para normalizar a cantidade de metabolitos.
Non se utilizaron métodos estatísticos para determinar previamente o tamaño da mostra.Os estudos metabolómicos anteriores destinados ao descubrimento de biomarcadores15,18 foron considerados como puntos de referencia para a determinación do tamaño e, en comparación con estes informes, a nosa mostra foi adecuada.Non se excluíron mostras da cohorte do estudo.As mostras de soro foron asignadas aleatoriamente a un grupo de descubrimento (306 casos, 74,6%) e a un grupo de validación interna (104 casos, 25,4%) para estudos metabolómicos non dirixidos.Tamén seleccionamos aleatoriamente 70 casos de cada grupo do conxunto de descubrimentos para estudos metabolómicos dirixidos.Os investigadores quedaron cegados á asignación do grupo durante a recollida e análise de datos LC-MS.As análises estatísticas de datos de metabolómica e experimentos celulares descríbense nas seccións respectivas Resultados, Lendas de figuras e Métodos.A cuantificación de triptófano celular, NADT e actividade glicolítica realizouse tres veces de forma independente con resultados idénticos.
Para obter máis información sobre o deseño do estudo, consulte o Resumo do informe Natural Portfolio asociado a este artigo.
Os datos de MS en bruto das características extraídas e os datos de MS normalizados do soro de referencia móstranse nos Datos complementarios 1 e Datos complementarios 2, respectivamente.As anotacións máximas para as características diferenciais preséntanse nos datos suplementarios 3. O conxunto de datos LUAD TCGA pódese descargar de https://portal.gdc.cancer.gov/.Os datos de entrada para trazar a gráfica indícanse nos datos fonte.Os datos de orixe fornecidos para este artigo.
National Lung Screening Study Group, etc. Redución da mortalidade por cancro de pulmón con tomografía computarizada de baixa dose.Norte de Inglaterra.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR e Prophet, PC Cribado do cancro de pulmón mediante TC helicoidal de baixa dose: resultados do National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Pantalla 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Redución da mortalidade por cancro de pulmón con cribado por TC volumétrica nun ensaio aleatorizado.Norte de Inglaterra.J. Med.382, 503–513 (2020).
Hora de publicación: 18-09-2023