O diagnóstico diferencial dos nódulos pulmonares identificados por tomografía computarizada (TC) segue a ser un reto na práctica clínica. Aquí, caracterizamos o metaboloma global de 480 mostras de soro, incluíndo controis sans, nódulos pulmonares benignos e adenocarcinoma pulmonar en estadio I. Os adenocarcinomas presentan perfís metabolómicos únicos, mentres que os nódulos benignos e os individuos sans teñen unha alta semellanza nos perfís metabolómicos. No grupo de descubrimento (n = 306), identificouse un conxunto de 27 metabolitos para diferenciar entre nódulos benignos e malignos. A AUC do modelo discriminante nos grupos de validación interna (n = 104) e validación externa (n = 111) foi de 0,915 e 0,945, respectivamente. A análise da vía revelou un aumento dos metabolitos glicolíticos asociados cunha diminución do triptófano no soro de adenocarcinoma pulmonar en comparación cos nódulos benignos e os controis sans, e suxeriu que a captación de triptófano promove a glicólise nas células do cancro de pulmón. O noso estudo destaca o valor dos biomarcadores de metabolitos séricos na avaliación do risco de nódulos pulmonares detectados por TC.
O diagnóstico precoz é fundamental para mellorar as taxas de supervivencia dos pacientes con cancro. Os resultados do Ensaio Nacional de Detección do Cancro de Pulmón dos Estados Unidos (NLST) e do Estudo Europeo NELSON demostraron que a detección con tomografía computarizada de baixa dose (TCBD) pode reducir significativamente a mortalidade por cancro de pulmón en grupos de alto risco1,2,3. Desde o uso xeneralizado da TCBD para a detección do cancro de pulmón, a incidencia de achados radiográficos incidentais de nódulos pulmonares asintomáticos seguiu aumentando4. Os nódulos pulmonares defínense como opacidades focais de ata 3 cm de diámetro5. Enfrontámonos a dificultades para avaliar a probabilidade de malignidade e xestionar o gran número de nódulos pulmonares detectados incidentalmente na TCBD. As limitacións da TC poden levar a exames de seguimento frecuentes e resultados falsos positivos, o que leva a intervencións innecesarias e tratamentos excesivos6. Polo tanto, existe a necesidade de desenvolver biomarcadores fiables e útiles para identificar correctamente o cancro de pulmón nas fases iniciais e diferenciar a maioría dos nódulos benignos na detección inicial7.
A análise molecular exhaustiva do sangue (soro, plasma, células mononucleares do sangue periférico), incluíndo a xenómica, a proteómica ou a metilación do ADN8,9,10, levou a un interese crecente no descubrimento de biomarcadores de diagnóstico para o cancro de pulmón. Mentres tanto, as abordaxes metabolómicas miden os produtos finais celulares que están influenciados por accións endóxenas e exóxenas e, polo tanto, aplícanse para predicir a aparición e o resultado da enfermidade. A cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS) é un método amplamente utilizado para estudos metabolómicos debido á súa alta sensibilidade e amplo rango dinámico, que pode abarcar metabolitos con diferentes propiedades fisicoquímicas11,12,13. Aínda que a análise metabolómica global do plasma/soro se utilizou para identificar biomarcadores asociados co diagnóstico do cancro de pulmón14,15,16,17 e a eficacia do tratamento18, os clasificadores de metabolitos séricos para distinguir entre nódulos pulmonares benignos e malignos aínda están por estudar moito. -investigación masiva.
O adenocarcinoma e o carcinoma de células escamosas son os dous subtipos principais de cancro de pulmón non microcítico (NSCLC). Varias probas de cribado por TC indican que o adenocarcinoma é o tipo histolóxico máis común de cancro de pulmón1,19,20,21. Neste estudo, empregamos cromatografía líquida de ultra rendemento con espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS) para realizar análises metabolómicas nun total de 695 mostras de soro, incluíndo controis sans, nódulos pulmonares benignos e ≤3 cm detectados por TC. Cribado de adenocarcinoma de pulmón en estadio I. Identificamos un panel de metabolitos séricos que distinguen o adenocarcinoma de pulmón dos nódulos benignos e dos controis sans. A análise de enriquecemento de vías revelou que o metabolismo anormal do triptófano e da glicosa son alteracións comúns no adenocarcinoma de pulmón en comparación cos nódulos benignos e os controis sans. Finalmente, establecemos e validamos un clasificador metabólico sérico con alta especificidade e sensibilidade para distinguir entre nódulos pulmonares malignos e benignos detectados por LDCT, o que pode axudar no diagnóstico diferencial precoz e na avaliación do risco.
No presente estudo, recolléronse retrospectivamente mostras de soro emparelladas por sexo e idade de 174 controis sans, 292 pacientes con nódulos pulmonares benignos e 229 pacientes con adenocarcinoma de pulmón en estadio I. As características demográficas dos 695 suxeitos móstranse na Táboa complementaria 1.
Como se mostra na Figura 1a, recolléronse un total de 480 mostras de soro no Centro Oncolóxico da Universidade Sun Yat-sen, incluíndo 174 mostras de control san (HC), 170 nódulos benignos (BN) e 136 mostras de adenocarcinoma de pulmón (AL) en estadio I. Cohorte de descubrimento para a elaboración de perfís metabolómicos non dirixidos mediante cromatografía líquida de ultrarrendimento-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS). Como se mostra na Figura Suplementaria 1, identificáronse metabolitos diferenciais entre AL e HC, LA e BN para establecer un modelo de clasificación e explorar máis a fondo a análise de vías diferenciais. 104 mostras recollidas polo Centro Oncolóxico da Universidade Sun Yat-sen e 111 mostras recollidas por outros dous hospitais foron sometidas a validación interna e externa, respectivamente.
a Poboación de estudo na cohorte de descubrimento que se someteu a unha análise metabolómica sérica global mediante cromatografía líquida de ultrarrendimento-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS). b Análise discriminante de mínimos cadrados parcial (PLS-DA) do metaboloma total de 480 mostras de soro da cohorte de estudo, incluíndo controis sans (HC, n = 174), nódulos benignos (BN, n = 170) e adenocarcinoma de pulmón en estadio I (Os Ánxeles, n = 136). +ESI, modo de ionización por electropulverización positiva, -ESI, modo de ionización por electropulverización negativa. c–e Os metabolitos con abundancias significativamente diferentes en dous grupos dados (proba de rango con signo de Wilcoxon bilateral, valor p axustado pola taxa de descubrimento falso, FDR <0,05) móstranse en vermello (cambio de pregamento > 1,2) e azul (cambio de pregamento < 0,83). ) mostrados no gráfico do volcán. f Mapa de calor de agrupamento xerárquico que mostra diferenzas significativas no número de metabolitos anotados entre LA e BN. Os datos de orixe ofrécense en forma de ficheiros de datos de orixe.
O metaboloma sérico total de 174 HC, 170 BN e 136 LA no grupo de descubrimento analizouse mediante análise UPLC-HRMS. Primeiro demostramos que as mostras de control de calidade (QC) agrúpanse estreitamente no centro dun modelo de análise de compoñentes principais (PCA) non supervisado, o que confirma a estabilidade do rendemento do estudo actual (Figura suplementaria 2).
Como se mostra na análise discriminante por mínimos cadrados parcial (PLS-DA) na Figura 1b, atopamos que había claras diferenzas entre LA e BN, LA e HC nos modos de ionización por electropulverización positivo (+ESI) e negativo (−ESI). Non obstante, non se atoparon diferenzas significativas entre BN e HC en condicións +ESI e -ESI.
Atopamos 382 características diferenciais entre LA e HC, 231 características diferenciais entre LA e BN e 95 características diferenciais entre BN e HC (proba de rangos con signo de Wilcoxon, FDR <0,05 e cambio múltiple >1,2 ou <0,83) (Figura .1c-e). Os picos foron anotados adicionalmente (Datos suplementarios 3) fronte a unha base de datos (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) por valor m/z, tempo de retención e busca do espectro de masas de fragmentación (detalles descritos na sección Métodos) 22. Finalmente, identificáronse 33 e 38 metabolitos anotados con diferenzas significativas na abundancia para LA fronte a BN (Figura 1f e Táboa suplementaria 2) e LA fronte a HC (Figura suplementaria 3 e Táboa suplementaria 2), respectivamente. En contraste, só se identificaron 3 metabolitos con diferenzas significativas na abundancia en BN e HC (Táboa suplementaria 2), o que é consistente coa superposición entre BN e HC en PLS-DA. Estes metabolitos diferenciais abarcan unha ampla gama de bioquímicos (Figura suplementaria 4). En conxunto, estes resultados demostran cambios significativos no metaboloma sérico que reflicten a transformación maligna do cancro de pulmón en estadio inicial en comparación cos nódulos pulmonares benignos ou os suxeitos sans. Mentres tanto, a semellanza do metaboloma sérico de BN e HC suxire que os nódulos pulmonares benignos poden compartir moitas características biolóxicas cos individuos sans. Dado que as mutacións no xene do receptor do factor de crecemento epidérmico (EGFR) son comúns no adenocarcinoma de pulmón subtipo 23, buscamos determinar o impacto das mutacións impulsoras no metaboloma sérico. Despois analizamos o perfil metabolómico xeral de 72 casos con estado EGFR no grupo de adenocarcinoma de pulmón. Curiosamente, atopamos perfís comparables entre pacientes con mutación EGFR (n = 41) e pacientes de tipo salvaxe EGFR (n = 31) na análise PCA (Figura suplementaria 5a). Non obstante, identificamos 7 metabolitos cuxa abundancia se alterou significativamente en pacientes con mutación do EGFR en comparación cos pacientes con EGFR de tipo salvaxe (proba t, p < 0,05 e cambio de pregamento > 1,2 ou < 0,83) (Figura suplementaria 5b). A maioría destes metabolitos (5 de 7) son acilcarnitinas, que desempeñan un papel importante nas vías de oxidación dos ácidos graxos.
Como se ilustra no fluxo de traballo mostrado na Figura 2a, os biomarcadores para a clasificación de nódulos obtivéronse empregando operadores de mínima contracción absoluta e selección baseada en 33 metabolitos diferenciais identificados en LA (n = 136) e BN (n = 170). Mellor combinación de variables (LASSO): modelo de regresión loxística binaria. Utilizouse a validación cruzada de dez veces para probar a fiabilidade do modelo. A selección de variables e a regularización dos parámetros axústanse mediante unha penalización de maximización de verosimilitude co parámetro λ24. A análise metabolómica global realizouse de forma independente nos grupos de validación interna (n = 104) e validación externa (n = 111) para probar o rendemento da clasificación do modelo discriminante. Como resultado, identificáronse 27 metabolitos no conxunto de descubrimento como o mellor modelo discriminante co maior valor medio de AUC (Fig. 2b), entre os cales 9 tiñan unha maior actividade e 18 unha menor actividade en LA en comparación con BN (Fig. 2c).
Fluxo de traballo para construír un clasificador de nódulos pulmonares, incluíndo a selección do mellor panel de metabolitos séricos no conxunto de descubrimento usando un modelo de regresión loxística binaria mediante validación cruzada de dez veces e a avaliación do rendemento preditivo en conxuntos de validación internos e externos. b Estatísticas de validación cruzada do modelo de regresión LASSO para a selección de biomarcadores metabólicos. Os números indicados anteriormente representan o número medio de biomarcadores seleccionados a un λ determinado. A liña punteada vermella representa o valor medio da AUC na lambda correspondente. As barras de erro grises representan os valores mínimos e máximos da AUC. A liña punteada indica o mellor modelo cos 27 biomarcadores seleccionados. AUC, área baixo a curva característica operativa do receptor (ROC). c Cambios de pregamento de 27 metabolitos seleccionados no grupo LA en comparación co grupo BN no grupo de descubrimento. Columna vermella: activación. A columna azul é un declive. d–f Curvas da característica operativa do receptor (ROC) que mostran a potencia do modelo discriminante baseado en 27 combinacións de metabolitos nos conxuntos de descubrimento, validación interna e externa. Os datos de orixe ofrécense en forma de ficheiros de datos de orixe.
Creouse un modelo de predición baseado nos coeficientes de regresión ponderados destes 27 metabolitos (Táboa suplementaria 3). A análise ROC baseada nestes 27 metabolitos produciu un valor de área baixo a curva (AUC) de 0,933, a sensibilidade do grupo de descubrimento foi de 0,868 e a especificidade foi de 0,859 (Fig. 2d). Mentres tanto, entre os 38 metabolitos diferenciais anotados entre LA e HC, un conxunto de 16 metabolitos alcanzou unha AUC de 0,902 cunha sensibilidade de 0,801 e unha especificidade de 0,856 para discriminar entre LA e HC (Figura suplementaria 6a-c). Tamén se compararon os valores de AUC baseados en diferentes limiares de cambio de pregamento para metabolitos diferenciais. Descubrimos que o modelo de clasificación tivo un mellor rendemento para discriminar entre LA e BN (HC) cando o nivel de cambio de pregamento se estableceu en 1,2 fronte a 1,5 ou 2,0 (Figura suplementaria 7a,b). O modelo de clasificación, baseado en 27 grupos de metabolitos, validouse aínda máis en cohortes internas e externas. A AUC foi de 0,915 (sensibilidade 0,867, especificidade 0,811) para a validación interna e de 0,945 (sensibilidade 0,810, especificidade 0,979) para a validación externa (Fig. 2e, f). Para avaliar a eficiencia interlaboratorio, analizáronse 40 mostras da cohorte externa nun laboratorio externo como se describe na sección Métodos. A precisión da clasificación alcanzou unha AUC de 0,925 (Figura suplementaria 8). Dado que o carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) é o segundo subtipo máis común de cancro de pulmón non microcítico (NSCLC) despois do adenocarcinoma de pulmón (LUAD), tamén probamos a utilidade potencial validada dos perfís metabólicos. BN e 16 casos de LUSC. A AUC de discriminación entre LUSC e BN foi de 0,776 (Figura suplementaria 9), o que indica unha peor capacidade en comparación coa discriminación entre LUAD e BN.
Os estudos demostraron que o tamaño dos nódulos nas imaxes de TC está positivamente correlacionado coa probabilidade de malignidade e segue a ser un determinante importante do tratamento dos nódulos25,26,27. A análise dos datos da gran cohorte do estudo de cribado NELSON mostrou que o risco de malignidade en suxeitos con ganglios <5 mm era incluso similar ao dos suxeitos sen ganglios28. Polo tanto, o tamaño mínimo que require monitorización regular por TC é de 5 mm, segundo o recomendado pola British Thoracic Society (BTS), e de 6 mm, segundo o recomendado pola Fleischner Society29. Non obstante, os nódulos maiores de 6 mm e sen características benignas evidentes, chamados nódulos pulmonares indeterminados (NPI), seguen a ser un desafío importante na avaliación e o tratamento na práctica clínica30,31. A continuación, examinamos se o tamaño dos nódulos influía nas sinaturas metabolómicas utilizando mostras agrupadas das cohortes de descubrimento e validación interna. Centrándonos en 27 biomarcadores validados, primeiro comparamos os perfís de PCA dos metabolomas de HC e BN sub-6 mm. Descubrimos que a maioría dos puntos de datos para HC e BN se solapaban, o que demostra que os niveis de metabolitos séricos eran similares en ambos os grupos (Fig. 3a). Os mapas de características en diferentes rangos de tamaño permaneceron conservados en BN e LA (Fig. 3b, c), mentres que se observou unha separación entre nódulos malignos e benignos no rango de 6 a 20 mm (Fig. 3d). Esta cohorte tiña unha AUC de 0,927, unha especificidade de 0,868 e unha sensibilidade de 0,820 para predicir a malignidade dos nódulos que miden de 6 a 20 mm (Fig. 3e, f). Os nosos resultados mostran que o clasificador pode capturar os cambios metabólicos causados pola transformación maligna temperá, independentemente do tamaño do nódulo.
ad Comparación dos perfís de PCA entre grupos especificados baseándose nun clasificador metabólico de 27 metabolitos. CC e BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. en LA 6–20 mm fronte a LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm e LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Curva da característica operativa do receptor (ROC) que mostra o rendemento do modelo discriminante para nódulos de 6–20 mm. f Os valores de probabilidade calculáronse baseándose no modelo de regresión loxística para nódulos que miden de 6–20 mm. A liña punteada gris representa o valor de corte óptimo (0,455). Os números anteriores representan a porcentaxe de casos proxectados para Os Ánxeles. Usar unha proba t de Student bilateral. PCA, análise de compoñentes principais. Área baixo a curva AUC. Os datos de orixe ofrécense en forma de ficheiros de datos de orixe.
Seleccionáronse catro mostras (de 44 a 61 anos) con tamaños de nódulos pulmonares similares (7 a 9 mm) para ilustrar o rendemento do modelo de predición de malignidade proposto (Fig. 4a, b). Na selección inicial, o Caso 1 presentouse como un nódulo sólido con calcificación, unha característica asociada á benignidade, mentres que o Caso 2 presentouse como un nódulo parcialmente sólido indeterminado sen características benignas evidentes. Tres roldas de tomografías computarizadas de seguimento mostraron que estes casos permaneceron estables durante un período de 4 anos e, polo tanto, consideráronse nódulos benignos (Fig. 4a). En comparación coa avaliación clínica das tomografías computarizadas seriadas, a análise de metabolitos séricos dunha soa dose co modelo clasificador actual identificou de forma rápida e correcta estes nódulos benignos baseándose en restricións probabilísticas (Táboa 1). A Figura 4b no caso 3 mostra un nódulo con signos de retracción pleural, que adoita asociarse á malignidade32. O Caso 4 presentouse como un nódulo parcialmente sólido indeterminado sen evidencia dunha causa benigna. Todos estes casos foron preditos como malignos segundo o modelo clasificador (Táboa 1). A avaliación do adenocarcinoma de pulmón demostrouse mediante exame histopatolóxico despois da cirurxía de resección pulmonar (Fig. 4b). Para o conxunto de validación externa, o clasificador metabólico predixo con precisión dous casos de nódulos pulmonares indeterminados maiores de 6 mm (Figura suplementaria 10).
Imaxes de TC da xanela axial dos pulmóns de dous casos de nódulos benignos. No caso 1, a TC despois de 4 anos mostrou un nódulo sólido estable de 7 mm con calcificación no lóbulo inferior dereito. No caso 2, a TC despois de 5 anos revelou un nódulo estable e parcialmente sólido cun diámetro de 7 mm no lóbulo superior dereito. b Imaxes de TC da xanela axial dos pulmóns e estudos patolóxicos correspondentes de dous casos de adenocarcinoma en estadio I antes da resección pulmonar. O caso 3 revelou un nódulo cun diámetro de 8 mm no lóbulo superior dereito con retracción pleural. O caso 4 revelou un nódulo de vidro esmerilado parcialmente sólido de 9 mm no lóbulo superior esquerdo. Tinción de hematoxilina e eosina (H&E) do tecido pulmonar resecado (barra de escala = 50 μm) que demostra o patrón de crecemento acinar do adenocarcinoma pulmonar. As frechas indican os nódulos detectados nas imaxes de TC. As imaxes de H&E son imaxes representativas de múltiples (>3) campos microscópicos examinados polo patólogo.
En conxunto, os nosos resultados demostran o valor potencial dos biomarcadores de metabolitos séricos no diagnóstico diferencial dos nódulos pulmonares, o que pode supoñer desafíos á hora de avaliar o cribado por TC.
Baseándonos nun panel de metabolitos diferenciais validado, procuramos identificar correlatos biolóxicos dos principais cambios metabólicos. A análise de enriquecemento de vías KEGG realizada por MetaboAnalyst identificou 6 vías comúns alteradas significativamente entre os dous grupos dados (LA vs. HC e LA vs. BN, p axustado ≤ 0,001, efecto > 0,01). Estes cambios caracterizáronse por alteracións no metabolismo do piruvato, no metabolismo do triptófano, no metabolismo da niacina e a nicotinamida, na glicólise, no ciclo TCA e no metabolismo das purinas (Fig. 5a). Despois, realizamos metabolómica dirixida para verificar os cambios principais mediante a cuantificación absoluta. Determinación de metabolitos comúns en vías comúnmente alteradas mediante espectrometría de masas de triplo cuadrupolo (QQQ) utilizando estándares de metabolitos auténticos. As características demográficas da mostra obxectivo do estudo metabolómico inclúense na Táboa suplementaria 4. En consonancia cos nosos resultados metabolómicos globais, a análise cuantitativa confirmou que a hipoxantina e a xantina, o piruvato e o lactato aumentaron na LA en comparación coa BN e a HC (Fig. 5b, c, p <0,05). Non obstante, non se atoparon diferenzas significativas nestes metabolitos entre a BN e a HC.
Análise de enriquecemento da vía KEGG de metabolitos significativamente diferentes no grupo LA en comparación cos grupos BN e HC. Utilizouse un Globaltest bilateral e os valores p axustáronse mediante o método Holm-Bonferroni (p axustada ≤ 0,001 e tamaño do efecto > 0,01). b–d Gráficos de violín que mostran os niveis de hipoxantina, xantina, lactato, piruvato e triptófano no soro HC, BN e LA determinados por LC-MS/MS (n = 70 por grupo). As liñas punteadas brancas e negras indican a mediana e o cuartil, respectivamente. e Gráfico de violín que mostra a expresión normalizada de ARNm de Log2TPM (transcritos por millón) de SLC7A5 e QPRT no adenocarcinoma de pulmón (n = 513) en comparación co tecido pulmonar normal (n = 59) no conxunto de datos LUAD-TCGA. A caixa branca representa o rango intercuartílico, a liña negra horizontal no centro representa a mediana e a liña negra vertical que se estende desde a caixa representa o intervalo de confianza (IC) do 95 %. f Gráfica de correlación de Pearson da expresión de SLC7A5 e GAPDH no adenocarcinoma de pulmón (n = 513) e no tecido pulmonar normal (n = 59) no conxunto de datos TCGA. A área gris representa o IC do 95 %. r, coeficiente de correlación de Pearson. g Niveis celulares normalizados de triptófano en células A549 transfectadas con control shRNA non específico (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinados por LC-MS/MS. Preséntase a análise estatística de cinco mostras bioloxicamente independentes en cada grupo. h Niveis celulares de NADt (NAD total, incluíndo NAD+ e NADH) en células A549 (NC) e células A549 con SLC7A5 knockdown (Sh1, Sh2). Preséntase a análise estatística de tres mostras bioloxicamente independentes en cada grupo. i A actividade glicolítica das células A549 antes e despois da inhibición de SLC7A5 medíuse mediante a taxa de acidificación extracelular (ECAR) (n = 4 mostras bioloxicamente independentes por grupo). 2-DG,2-desoxi-D-glicosa. A proba t de Student bilateral utilizouse en (b-h). En (g-i), as barras de erro representan a media ± desviación estándar, cada experimento realizouse tres veces de forma independente e os resultados foron similares. Os datos fonte ofrécense en forma de ficheiros de datos fonte.
Tendo en conta o impacto significativo do metabolismo alterado do triptófano no grupo LA, tamén avaliamos os niveis séricos de triptófano nos grupos HC, BN e LA mediante QQQ. Descubrimos que o triptófano sérico estaba reducido en LA en comparación con HC ou BN (p < 0,001, Figura 5d), o que é consistente con achados previos de que os niveis circulantes de triptófano son máis baixos en pacientes con cancro de pulmón que en controis sans do grupo de control33,34,35. Outro estudo que utilizou o trazador PET/TC 11C-metil-L-triptófano descubriu que o tempo de retención do sinal do triptófano no tecido de cancro de pulmón aumentaba significativamente en comparación coas lesións benignas ou o tecido normal36. A nosa hipótese é que a diminución do triptófano no soro de LA pode reflectir a captación activa de triptófano polas células de cancro de pulmón.
Tamén se sabe que o produto final da vía da quinurenina no catabolismo do triptófano é o NAD+37,38, que é un substrato importante para a reacción do gliceraldehído-3-fosfato co 1,3-bisfosfoglicerato na glicólise39. Aínda que estudos previos se centraron no papel do catabolismo do triptófano na regulación inmunitaria, nós buscamos dilucidar a interacción entre a desregulación do triptófano e as vías glicolíticas observadas no presente estudo. Sábese que o membro 5 da familia de transportadores de solutos 7 (SLC7A5) é un transportador de triptófano43,44,45. A fosforribosiltransferase do ácido quinoclínico (QPRT) é un encima situado augas abaixo da vía da quinurenina que converte o ácido quinoclínico en NAMN46. A inspección do conxunto de datos LUAD TCGA revelou que tanto SLC7A5 como QPRT estaban significativamente regulados positivamente no tecido tumoral en comparación co tecido normal (Fig. 5e). Este aumento observouse nas etapas I e II, así como nas etapas III e IV do adenocarcinoma de pulmón (Figura suplementaria 11), o que indica alteracións temperás no metabolismo do triptófano asociadas á tumorexénese.
Ademais, o conxunto de datos LUAD-TCGA mostrou unha correlación positiva entre a expresión do ARNm de SLC7A5 e GAPDH en mostras de pacientes con cancro (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f). En contraste, non se atopou ningunha correlación significativa entre tales sinaturas xénicas no tecido pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f). A supresión de SLC7A5 (Figura suplementaria 12) en células A549 reduciu significativamente os niveis celulares de triptófano e NAD(H) (Figura 5g, h), o que resultou nunha actividade glicolítica atenuada medida pola taxa de acidificación extracelular (ECAR) (Figura 1). 5i). Polo tanto, baseándonos nos cambios metabólicos no soro e na detección in vitro, formulamos a hipótese de que o metabolismo do triptófano pode producir NAD+ a través da vía da quinurenina e desempeñar un papel importante na promoción da glicólise no cancro de pulmón.
Os estudos demostraron que un gran número de nódulos pulmonares indeterminados detectados por TC de baixa densidade pode levar á necesidade de probas adicionais como a PET-TC, a biopsia pulmonar e o sobretratamento debido a un diagnóstico falso positivo de malignidade.31 Como se mostra na Figura 6, o noso estudo identificou un panel de metabolitos séricos con potencial valor diagnóstico que pode mellorar a estratificación do risco e o posterior tratamento dos nódulos pulmonares detectados por TC.
Os nódulos pulmonares avalíanse mediante tomografía computarizada de dose baixa (TCBD) con características de imaxe que suxiren causas benignas ou malignas. O resultado incerto dos nódulos pode levar a visitas de seguimento frecuentes, intervencións innecesarias e sobretratamento. A inclusión de clasificadores metabólicos séricos con valor diagnóstico pode mellorar a avaliación do risco e o posterior tratamento dos nódulos pulmonares. Tomografía por emisión de positróns por PET.
Os datos do estudo NLST dos Estados Unidos e do estudo NELSON europeo suxiren que a detección de grupos de alto risco con tomografía computarizada de dose baixa (TCBD) pode reducir a mortalidade por cancro de pulmón1,3. Non obstante, a avaliación do risco e a posterior xestión clínica dun gran número de nódulos pulmonares incidentais detectados por TCBD seguen sendo os máis complexos. O obxectivo principal é optimizar a clasificación correcta dos protocolos existentes baseados na TCBD mediante a incorporación de biomarcadores fiables.
Identificáronse certos biomarcadores moleculares, como os metabolitos do sangue, comparando o cancro de pulmón con controis sans15,17. No presente estudo, centrámonos na aplicación da análise metabolómica sérica para distinguir entre nódulos pulmonares benignos e malignos detectados incidentalmente por LDCT. Comparamos o metaboloma sérico global de mostras de control san (HC), nódulos pulmonares benignos (BN) e adenocarcinoma de pulmón (AL) en estadio I mediante a análise UPLC-HRMS. Descubrimos que o HC e o BN tiñan perfís metabólicos similares, mentres que o AL mostraba cambios significativos en comparación co HC e o BN. Identificamos dous conxuntos de metabolitos séricos que diferencian o AL do HC e do BN.
O esquema actual de identificación de nódulos benignos e malignos baseado na TC de baixa densidade (LDCT) baséase principalmente no tamaño, a densidade, a morfoloxía e a taxa de crecemento dos nódulos ao longo do tempo30. Estudos previos demostraron que o tamaño dos nódulos está estreitamente relacionado coa probabilidade de cancro de pulmón. Mesmo en pacientes de alto risco, o risco de malignidade en ganglios <6 mm é <1 %. O risco de malignidade para nódulos que miden de 6 a 20 mm oscila entre o 8 % e o 64 %30. Polo tanto, a Sociedade Fleischner recomenda un diámetro de corte de 6 mm para o seguimento rutineiro por TC.29 Non obstante, a avaliación do risco e o tratamento dos nódulos pulmonares indeterminados (NPI) maiores de 6 mm non se realizaron adecuadamente31. O tratamento actual das cardiopatías conxénitas adoita basearse na vixilancia expectante con monitorización frecuente por TC.
Baseándonos no metaboloma validado, demostramos por primeira vez a superposición das sinaturas metabolómicas entre individuos sans e nódulos benignos <6 mm. A semellanza biolóxica é consistente cos achados previos da TC que indican que o risco de malignidade para nódulos <6 mm é tan baixo como para suxeitos sen nódulos.30 Cómpre sinalar que os nosos resultados tamén demostran que os nódulos benignos <6 mm e ≥6 mm teñen unha alta semellanza nos perfís metabolómicos, o que suxire que a definición funcional da etioloxía benigna é consistente independentemente do tamaño do nódulo. Polo tanto, os paneis modernos de metabolitos séricos de diagnóstico poden proporcionar un único ensaio como proba de descarte cando os nódulos se detectan inicialmente na TC e potencialmente reducir a monitorización seriada. Ao mesmo tempo, o mesmo panel de biomarcadores metabólicos distinguiu os nódulos malignos ≥6 mm de tamaño dos nódulos benignos e proporcionou predicións precisas para NPI de tamaño similar e características morfolóxicas ambiguas nas imaxes da TC. Este clasificador do metabolismo sérico tivo un bo rendemento á hora de predicir a malignidade dos nódulos ≥6 mm cunha AUC de 0,927. En conxunto, os nosos resultados indican que as sinaturas metabolómicas séricas únicas poden reflectir especificamente os cambios metabólicos inducidos por tumores temperáns e ter un valor potencial como preditores de risco, independentemente do tamaño do nódulo.
Cabe destacar que o adenocarcinoma de pulmón (LUAD) e o carcinoma de células escamosas (LUSC) son os principais tipos de cancro de pulmón non microcítico (NSCLC). Dado que o LUSC está fortemente asociado co consumo de tabaco47 e o LUSC é a histoloxía máis común dos nódulos pulmonares incidentais detectados na TC48, o noso modelo clasificador foi construído especificamente para mostras de adenocarcinoma en estadio I. Wang e os seus colegas tamén se centraron no LUAD e identificaron nove sinaturas lipídicas mediante lipidómica para distinguir o cancro de pulmón en estadio inicial dos individuos sans17. Probamos o modelo clasificador actual en 16 casos de LUSC en estadio I e 74 nódulos benignos e observamos unha baixa precisión de predición de LUSC (AUC 0,776), o que suxire que o LUAD e o LUSC poden ter as súas propias sinaturas metabolómicas. De feito, demostrouse que o LUAD e o LUSC difiren en etioloxía, orixe biolóxica e aberracións xenéticas49. Polo tanto, deberían incluírse outros tipos de histoloxía nos modelos de adestramento para a detección poboacional do cancro de pulmón nos programas de cribado.
Aquí, identificamos as seis vías alteradas con maior frecuencia no adenocarcinoma de pulmón en comparación con controis sans e nódulos benignos. A xantina e a hipoxantina son metabolitos comúns da vía metabólica das purinas. En consonancia cos nosos resultados, os intermediarios asociados co metabolismo das purinas aumentaron significativamente no soro ou nos tecidos de pacientes con adenocarcinoma de pulmón en comparación con controis sans ou pacientes na fase preinvasiva15,50. Os niveis elevados de xantina e hipoxantina no soro poden reflectir o anabolismo que requiren as células cancerosas que proliferan rapidamente. A desregulación do metabolismo da glicosa é unha característica ben coñecida do metabolismo do cancro51. Aquí, observamos un aumento significativo do piruvato e do lactato no grupo LA en comparación co grupo HC e BN, o que é consistente con informes previos de anomalías da vía glicolítica nos perfís do metaboloma sérico de pacientes con cancro de pulmón non microcítico (NSCLC) e controis sans. Os resultados son consistentes52,53.
É importante destacar que observamos unha correlación inversa entre o metabolismo do piruvato e do triptófano no soro dos adenocarcinomas de pulmón. Os niveis séricos de triptófano reducíronse no grupo LA en comparación co grupo HC ou BN. Curiosamente, un estudo previo a grande escala cunha cohorte prospectiva descubriu que os niveis baixos de triptófano circulante estaban asociados cun maior risco de cancro de pulmón 54. O triptófano é un aminoácido esencial que obtemos integramente dos alimentos. Concluímos que a depleción de triptófano sérico no adenocarcinoma de pulmón pode reflectir a rápida depleción deste metabolito. É ben sabido que o produto final do catabolismo do triptófano a través da vía da quinurenina é a fonte da síntese de NAD+ de novo. Dado que o NAD+ se produce principalmente a través da vía de rescate, a importancia do NAD+ no metabolismo do triptófano na saúde e na enfermidade aínda está por determinar46. A nosa análise da base de datos TCGA mostrou que a expresión do transportador de solutos do transportador de triptófano 7A5 (SLC7A5) aumentou significativamente no adenocarcinoma de pulmón en comparación cos controis normais e correlacionouse positivamente coa expresión do encima glicolítico GAPDH. Estudos previos centráronse principalmente no papel do catabolismo do triptófano na supresión da resposta inmunitaria antitumoral40,41,42. Aquí demostramos que a inhibición da captación de triptófano pola supresión de SLC7A5 nas células de cancro de pulmón resulta nunha diminución posterior nos niveis celulares de NAD e unha atenuación concomitante da actividade glicolítica. En resumo, o noso estudo proporciona unha base biolóxica para os cambios no metabolismo sérico asociados coa transformación maligna do adenocarcinoma de pulmón.
As mutacións do EGFR son as mutacións impulsoras máis comúns en pacientes con NSCLC. No noso estudo, descubrimos que os pacientes coa mutación do EGFR (n = 41) tiñan perfís metabolómicos xerais similares aos pacientes con EGFR de tipo salvaxe (n = 31), aínda que atopamos niveis séricos reducidos dalgúns pacientes con mutacións do EGFR en pacientes con acilcarnitina. A función establecida das acilcarnitinas é transportar grupos acilo do citoplasma á matriz mitocondrial, o que leva á oxidación dos ácidos graxos para producir enerxía 55. En consonancia cos nosos achados, un estudo recente tamén identificou perfís metabolómicos similares entre tumores con EGFR mutante e de tipo salvaxe mediante a análise do metaboloma global de 102 mostras de tecido de adenocarcinoma de pulmón 50. Curiosamente, tamén se atopou contido de acilcarnitina no grupo mutante do EGFR. Polo tanto, pode ser necesario estudar máis se os cambios nos niveis de acilcarnitina reflicten os cambios metabólicos inducidos por EGFR e as vías moleculares subxacentes.
En conclusión, o noso estudo establece un clasificador metabólico sérico para o diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares e propón un fluxo de traballo que pode optimizar a avaliación de riscos e facilitar a xestión clínica baseada no cribado mediante tomografía computarizada.
Este estudo foi aprobado polo Comité de Ética do Hospital Oncolóxico da Universidade Sun Yat-sen, o Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen e o Comité de Ética do Hospital Oncolóxico da Universidade de Zhengzhou. Nos grupos de descubrimento e validación interna, recolléronse 174 soros de individuos sans e 244 soros de nódulos benignos de individuos que se sometían a exames médicos anuais no Departamento de Control e Prevención do Cancro do Centro Oncolóxico da Universidade Sun Yat-sen, e 166 soros de nódulos benignos. Os adenocarcinomas de pulmón en estadio I recolléronse do Centro Oncolóxico da Universidade Sun Yat-sen. Na cohorte de validación externa, houbo 48 casos de nódulos benignos, 39 casos de adenocarcinoma de pulmón en estadio I do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen e 24 casos de adenocarcinoma de pulmón en estadio I do Hospital Oncolóxico de Zhengzhou. O Centro Oncolóxico da Universidade Sun Yat-sen tamén recolleu 16 casos de cancro de pulmón escamoso en estadio I para probar a capacidade diagnóstica do clasificador metabólico establecido (as características dos pacientes móstranse na Táboa suplementaria 5). As mostras da cohorte de descubrimento e da cohorte de validación interna recolléronse entre xaneiro de 2018 e maio de 2020. As mostras para a cohorte de validación externa recolléronse entre agosto de 2021 e outubro de 2022. Para minimizar o sesgo de xénero, asignouse un número aproximadamente igual de casos masculinos e femininos a cada cohorte. Equipo de Descubrimento e Equipo de Revisión Interna. O xénero dos participantes determinouse en función da autodeclaración. Obtivose o consentimento informado de todos os participantes e non se proporcionou ningunha compensación. Os suxeitos con nódulos benignos foron aqueles cunha puntuación de tomografía computarizada estable aos 2 a 5 anos no momento da análise, agás 1 caso da mostra de validación externa, que se recolleu preoperatoriamente e se diagnosticou mediante histopatoloxía. Coa excepción da bronquite crónica. Os casos de adenocarcinoma de pulmón recolléronse antes da resección pulmonar e confirmáronse mediante diagnóstico patolóxico. As mostras de sangue en xaxún recolléronse en tubos de separación de soro sen ningún anticoagulante. As mostras de sangue coaguláronse durante 1 hora a temperatura ambiente e despois centrifugáronse a 2851 × g durante 10 minutos a 4 °C para recoller o sobrenadante do soro. As alícuotas de soro conxeláronse a -80 °C ata a extracción dos metabolitos. O Departamento de Prevención do Cancro e Exames Médicos do Centro Oncolóxico da Universidade Sun Yat-sen recolleu un conxunto de soro de 100 doadores sans, incluídos un número igual de homes e mulleres de entre 40 e 55 anos. Mesturáronse volumes iguais de cada mostra de doador, o conxunto resultante alícuotouse e almacenouse a -80 °C. A mestura de soro utilizouse como material de referencia para o control de calidade e a estandarización de datos.
O soro de referencia e as mostras de proba descongeláronse e os metabolitos extraéronse empregando un método de extracción combinado (MTBE/metanol/auga) 56. En resumo, mesturáronse 50 μl de soro con 225 μl de metanol xeado e 750 μl de metil terc-butiléter (MTBE) xeado. Axitouse a mestura e incubouse en xeo durante 1 hora. Despois, as mostras mesturáronse e axitáronse en vórtice con 188 μl de auga de grao MS que contiña estándares internos (13C-lactato, 13C3-piruvato, 13C-metionina e 13C6-isoleucina, adquiridos a Cambridge Isotope Laboratories). A continuación, a mestura centrifugouse a 15.000 × g durante 10 min a 4 °C e a fase inferior transferiuse a dous tubos (125 μL cada un) para a análise LC-MS en modos positivo e negativo. Finalmente, a mostra evaporouse ata secar nun concentrador de baleiro de alta velocidade.
Os metabolitos secos reconstituíronse en 120 μl de acetonitrilo ao 80 %, axitáronse en vórtice durante 5 min e centrifugáronse a 15 000 × g durante 10 min a 4 °C. Os sobrenadantes transferíronse a frascos de vidro ámbar con microinsertos para estudos metabolómicos. Análise metabolómica non dirixida nunha plataforma de cromatografía líquida de ultra rendemento-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS). Os metabolitos separáronse empregando un sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC e unha columna de amida ACQUITY BEH (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). No modo de ións positivos, as fases móbiles foron acetonitrilo ao 95 % (A) e ao 50 % (B), cada unha contiña 10 mmol/L de acetato de amonio e ácido fórmico ao 0,1 %. En modo negativo, as fases móbiles A e B contiñan un 95 % e un 50 % de acetonitrilo, respectivamente, e ambas as fases contiñan 10 mmol/L de acetato de amonio, pH = 9. O programa de gradiente foi o seguinte: 0–0,5 min, 2 % de B; 0,5–12 min, 2–50 % de B; 12–14 min, 50–98 % de B; 14–16 min, 98 % de B; 16–16,1 min, 98 –2 % de B; 16,1–20 min, 2 % de B. A columna mantívose a 40 °C e a mostra a 10 °C no mostrador automático. O caudal foi de 0,3 ml/min e o volume de inxección foi de 3 μl. Un espectrómetro de masas Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) cunha fonte de ionización por electropulverización (ESI) operou en modo de exploración completa e acoplouse ao modo de monitorización ddMS2 para recoller grandes volumes de datos. Os parámetros de MS axustáronse do seguinte xeito: tensión de pulverización +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura capilar 320 °C, gas de protección 40 arb, gas auxiliar 10 arb, temperatura do quentador da sonda 350 °C, rango de exploración 70–1050 m/h, resolución 70 000. Os datos adquiríronse usando Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Para avaliar a calidade dos datos, xeráronse mostras agrupadas de control de calidade (QC) extraendo alícuotas de 10 μL do sobrenadante de cada mostra. Analizáronse seis inxeccións de mostras de control de calidade ao comezo da secuencia analítica para avaliar a estabilidade do sistema UPLC-MS. A continuación, introdúcense periodicamente mostras de control de calidade no lote. Os 11 lotes de mostras de soro deste estudo analizáronse mediante LC-MS. Utilizáronse alícuotas dunha mestura agrupada de soro de 100 doadores sans como material de referencia nos respectivos lotes para monitorizar o proceso de extracción e axustar os efectos lote a lote. Realizouse unha análise metabolómica non dirixida da cohorte de descubrimento, a cohorte de validación interna e a cohorte de validación externa no Centro de Metabolómica da Universidade Sun Yat-sen. O laboratorio externo do Centro de Análise e Probas da Universidade Tecnolóxica de Guangdong tamén analizou 40 mostras da cohorte externa para probar o rendemento do modelo clasificador.
Tras a extracción e a reconstitución, a cuantificación absoluta dos metabolitos séricos mediuse mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución con espectrometría de masas en tándem (cuadrupolo triplo Agilent 6495) cunha fonte de ionización por electropulverización (ESI) en modo de monitorización de reaccións múltiples (MRM). Utilizouse unha columna de amida ACQUITY BEH (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) para separar os metabolitos. A fase móbil consistía en acetonitrilo ao 90 % (A) e ao 5 % (B) con acetato de amonio a 10 mmol/L e unha solución de amoníaco ao 0,1 %. O programa de gradiente foi o seguinte: 0–1,5 min, 0 % de B; 1,5–6,5 min, 0–15 % de B; 6,5–8 min, 15 % de B; 8–8,5 min, 15 %–0 % de B; 8,5–11,5 min, 0 % de B. A columna mantívose a 40 °C e a mostra a 10 °C no mostrador automático. O caudal foi de 0,3 mL/min e o volume de inxección foi de 1 μL. Os parámetros de MS establecéronse do seguinte xeito: tensión capilar ±3,5 kV, presión do nebulizador 35 psi, fluxo de gas da vaíña 12 L/min, temperatura do gas da vaíña 350 °C, temperatura do gas de secado 250 °C e fluxo de gas de secado 14 l/min. As conversións MRM de triptófano, piruvato, lactato, hipoxantina e xantina foron 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 e 151,0–107,9 respectivamente. Os datos recolléronse usando Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Para as mostras de soro, cuantificáronse o triptófano, o piruvato, o lactato, a hipoxantina e a xantina empregando curvas de calibración de solucións de mestura estándar. Para as mostras celulares, o contido de triptófano normalizouse con respecto ao estándar interno e á masa de proteína celular.
A extracción de picos (m/z e tempo de retención (RT)) realizouse empregando Compound Discovery 3.1 e TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Para eliminar as posibles diferenzas entre lotes, cada pico característico da mostra de ensaio dividiuse polo pico característico do material de referencia do mesmo lote para obter a abundancia relativa. As desviacións estándar relativas dos estándares internos antes e despois da estandarización móstranse na Táboa suplementaria 6. As diferenzas entre os dous grupos caracterizáronse pola taxa de falso descubrimento (FDR < 0,05, proba de rango con signo de Wilcoxon) e o cambio de pregamento (> 1,2 ou < 0,83). Os datos brutos de MS das características extraídas e os datos de MS corrixidos para o soro de referencia móstranse nos Datos suplementarios 1 e nos Datos suplementarios 2, respectivamente. A anotación de picos realizouse en función de catro niveis de identificación definidos, incluíndo metabolitos identificados, compostos supostamente anotados, clases de compostos supostamente caracterizadas e compostos descoñecidos 22. Baseándose nas buscas na base de datos en Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), seleccionáronse finalmente como intermedios entre o metaboloma diferencial compostos biolóxicos con estándares validados coincidentes de MS/MS ou anotacións de coincidencia exacta en mzCloud (puntuación > 85) ou Chemspider. As anotacións de pico para cada característica inclúense nos Datos Suplementarios 3. Utilizouse MetaboAnalyst 5.0 para a análise univariante da abundancia de metabolitos normalizados por suma. MetaboAnalyst 5.0 tamén avaliou a análise de enriquecemento da vía KEGG baseada en metabolitos significativamente diferentes. A análise de compoñentes principais (PCA) e a análise discriminante de mínimos cadrados parciais (PLS-DA) analizáronse usando o paquete de software ropls (v.1.26.4) con normalización de pila e escalado automático. O modelo óptimo de biomarcadores de metabolitos para predicir a malignidade dos nódulos xerouse usando regresión loxística binaria con menor retracción absoluta e operador de selección (LASSO, paquete R v.4.1-3). O rendemento do modelo discriminante nos conxuntos de detección e validación caracterizouse mediante a estimación da AUC baseada na análise ROC segundo o paquete pROC (v.1.18.0.). O límite de probabilidade óptimo obtívose baseándose no índice de Youden máximo do modelo (sensibilidade + especificidade – 1). As mostras con valores menores ou maiores que o limiar serán preditas como nódulos benignos e adenocarcinoma de pulmón, respectivamente.
Cultiváronse células A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) en medio F-12K que contiña FBS ao 10 %. Inseríronse secuencias de ARN de forquita curta (shRNA) dirixidas a SLC7A5 e un control non dirixido (NC) no vector lentiviral pLKO.1-puro. As secuencias antisentido de shSLC7A5 son as seguintes: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Os anticorpos contra SLC7A5 (#5347) e tubulina (#2148) adquiriuse a Cell Signaling Technology. Os anticorpos contra SLC7A5 e tubulina utilizáronse a unha dilución de 1:1000 para a análise de Western blot.
A proba de estrés glicolítico Seahorse XF mide os niveis de acidificación extracelular (ECAR). No ensaio, administráronse glicosa, oligomicina A e 2-DG secuencialmente para avaliar a capacidade glicolítica celular medida por ECAR.
As células A549 transfectadas con control non dirixido (NC) e shSLC7A5 (Sh1, Sh2) cultiváronse durante a noite en placas de 10 cm de diámetro. Os metabolitos celulares extraéronse con 1 ml de metanol acuoso ao 80 % arrefriado con xeo. As células da solución de metanol raspáronse, recolléronse nun tubo novo e centrifugáronse a 15 000 × g durante 15 min a 4 °C. Recolléronse 800 µl de sobrenadante e secáronse cun concentrador de baleiro de alta velocidade. Despois, analizáronse os niveis de triptófano nos gránulos de metabolitos secos mediante LC-MS/MS, como se describiu anteriormente. Os niveis celulares de NAD(H) nas células A549 (NC e shSLC7A5) medíronse cun kit colorimétrico cuantitativo de NAD+/NADH (n.º K337, BioVision) segundo as instrucións do fabricante. Os niveis de proteínas medíronse para cada mostra para normalizar a cantidade de metabolitos.
Non se empregaron métodos estatísticos para determinar preliminarmente o tamaño da mostra. Os estudos metabolómicos previos destinados ao descubrimento de biomarcadores15,18 consideráronse como puntos de referencia para a determinación do tamaño e, en comparación con estes informes, a nosa mostra foi axeitada. Non se excluíu ningunha mostra da cohorte do estudo. As mostras de soro asignáronse aleatoriamente a un grupo de descubrimento (306 casos, 74,6 %) e a un grupo de validación interna (104 casos, 25,4 %) para estudos metabolómicos non dirixidos. Tamén seleccionamos aleatoriamente 70 casos de cada grupo do conxunto de descubrimento para estudos metabolómicos dirixidos. Os investigadores estaban cegos á asignación de grupos durante a recollida e análise de datos de LC-MS. As análises estatísticas dos datos metabolómicos e os experimentos celulares descríbense nas respectivas seccións de Resultados, Lendas de Figuras e Métodos. A cuantificación do triptófano celular, o NADT e a actividade glicolítica realizouse tres veces de forma independente con resultados idénticos.
Para obter máis información sobre o deseño do estudo, consulta o resumo do Informe de Portfolio Natural asociado a este artigo.
Os datos de MS brutos das características extraídas e os datos de MS normalizados do soro de referencia móstranse nos Datos suplementarios 1 e nos Datos suplementarios 2, respectivamente. As anotacións de picos para as características diferenciais preséntanse nos Datos suplementarios 3. O conxunto de datos LUAD TCGA pódese descargar de https://portal.gdc.cancer.gov/. Os datos de entrada para trazar o gráfico ofrécense nos datos de orixe. Os datos de orixe ofrécense para este artigo.
Grupo Nacional de Estudo de Cribado Pulmonar, etc. Redución da mortalidade por cancro de pulmón con tomografía computarizada de baixa dose. Norte de Inglaterra. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR e Prophet, PC. Cribado do cancro de pulmón mediante TC helicoidal de baixa dose: resultados do Estudo Nacional de Cribado Pulmonar (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Redución da mortalidade por cancro de pulmón con cribado por TC volumétrica nun ensaio aleatorizado. Norte de Inglaterra. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Data de publicación: 18 de setembro de 2023